一种检测胆管癌生物标志物的新方法

使用质谱法鉴定和定量胆管癌生物标志物

新的研究自然科学报告描述了一种检测细胞外囊泡中胆管癌生物标志物的方法。

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在研究实验室中使用更安全的SARS-COV-2

在疾病控制和预防中心(CDC)的中心,揭示了冠心病等超微结构形态,例如SARS-COV-2。照片学分:Alissa Eckert,MS;丹希格斯,麦姆纳姆
来自CDC的SARS-COV-2插图;照片学分:Alissa Eckert,MS;丹希格斯,妈妈
E =信封;m =膜

全球大流行需要科学研究来了解病毒病原体。在像SARS-COV-2这样的小型冠状病毒,COVID-19的致病剂面对,全球科学家的重点努力更为必要。然而,由于SARS-COV-2导致人类疾病,研究努力受到物理实验室的限制,该实验室能够处理培训所需的遏制和培训的人员,以处理这些设施中的病原体。但是,如果我们通过工程绕过限制性设施要求,可以使用综合性,复制缺陷的SARS-COV-2,更多的研究人员可以使用更多的研究人员来研究大流行冠状病毒,扩大测试和开发方法的能力,以减弱其破坏性效果人类?

挑战是开发SARS-COV-2的衍生物,反映其在细胞中的表现方式是如何妥协,使得它不能超过一段时间感染细胞。也就是说,病毒可以进入细胞或被引入细胞并重复,但无法产生传染病,如果不使用特殊的实验室设施,可以提供扩大研究能力的途径。可以创建该复制有缺陷的SARS-COV-2以编码检查其生命周期所需的基因组,而不会成为完全传染性病毒。实际上,这种复制缺陷的SARS-COV-2版本可以包括额外的遗传元素,可用于控制其表达,跟踪细胞中的病毒并测量其复制的水平。这项任务是由威斯康星大学 - 麦迪逊大学的Bill Sudgen博士进行的Mcardle癌症研究实验室,由研究生Rebecca Hutcheson在介绍中解释的“使病毒导致Covid-19安全研究“。

战略制定更安全的病毒的创建

基于本介绍,实验室的制造SARS-COV-2的方法更广泛地用于研究,基于应用于研究人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的类似技术,导致获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)的病毒。(病毒学家喜欢他们的首字母缩略词!)特别是一种复制缺陷的SARS-COV-2,可以在普通的生物安全2级实验室中研究,更有限的生物安全级别3设施如下:

  1. 仅含有所需的遗传元件的RNA病毒的合成DNA版本。
  2. 去除负责产生可能感染更多细胞的病毒的结构蛋白的编码序列。
  3. 用报告基因替换病毒基因组的DNA版本中的结构蛋白。
  4. 使用诱导型启动子控制病毒基因组表达。
  5. 为膜和包膜结构蛋白创造单独的构造,其可以添加到培养细胞中以包装复制缺陷的病毒。

产生合成的SARS-COV-2基因组

创建合成DNA版本的RNA病毒似乎足够简单,因为SARS-COV-2已经在识别后不久被测序并发布。通过合成病毒基因组,在创建此版本的SARS-COV-2时,不需要在任何点使用传染性病毒。相反,合成的DNA片段只需要连接在一起以创造一个全长版本的病毒。但是,这并不容易完成任务。SARS-COV-2基因组是30,000个碱基,可以产生的最长DNA片段是2,000个碱基。此外,这种合成片段需要在细菌中生长并收获以产生足够的DNA供使用。在一些情况下,合成的片段可能对细菌有毒。因此,需要时间和精力来创建一个全长合成DNA基因组的SAR-COV-2 RNA基因组,其正确地针对所需的元素,而不是野生型病毒。

从地下构建SARS-COV-2的另一个优点是用于合成所需病毒蛋白的密码子可以针对哺乳动物细胞进行优化。当使用SARS-COV-2序列时,来自McARDLE的小组花了时间来实现这一步骤。

当您可以从划痕合成DNA序列时,除去负责感染性的结构元素,并且用其他编码序列替换它们很容易。对于SARS-COV-2的30KB DNA版本,这些结构元件是包络和膜蛋白。没有构成大多数病毒颗粒外层的膜和包膜蛋白,病毒不能感染其他细胞。而不是将该空间留在DNA衍生物基因组空中,来自McARDLE的组选择以用两个报告基因取代结构编码区:Nanoluc®Luciferase.和绿色荧光蛋白。记者基因均提供检测该细胞内和培养的细胞介质内部细胞内和培养的细胞介质的选择,同时提供一种监测病毒的生产方法。Promega通过提供了一个支持Sugden实验室glomax®发现系统用于测量复制缺陷SARS-COV-2 DNA构建体的荧光和发光。

压制病毒蛋白的表达

对病毒表达的另一种控制水平是需要诱导开始转录和翻译的病毒基因组的启动子。研究团队选择了人类Kox1的Krab域融合到Tet压缩机或Tet-Krab.。该蛋白质融合在细胞中组成型表达,与DNA中的TET元素结合,沉默下游的任何表达。然而,一旦添加了十二胞环素,TET-Krab不再结合并且启动子变得活性。为复制缺陷的SARS-COV-2 DNA构建体实施TET-KRAB系统。因此,当将该构建体转染到培养的细胞中时,未表达病毒蛋白,直至加入诱导症,柔软霉素。

单独表达结构蛋白

类似于其他病毒包装系统,Sudgen实验室开发了一种技术,可分别提供结构蛋白来重建传染性病毒颗粒,但是一个限制在一轮感染中。也就是说,合成病毒基因组缺乏膜和包膜蛋白,因此即使病毒在细胞内感染并重复,缺陷基因组也不能组装感染性病毒颗粒,停止随后的培养细胞的感染。使用人的293细胞系作为通过将编码蛋白质的DNA在诱导型TET-KRAB元素的控制中与细胞系基因组相接到产生膜蛋白的基础。与复制有缺陷的SARS-COV-2一样,膜蛋白只能在加入糖苷霉素时产生。使用不同的技术产生包络蛋白:RNA转染。通过将短寿命的RNA和复制缺陷的SARS-COV-2构建成293个细胞,具有集成膜蛋白,可以生产一种传染性SARS-COV-2,尽管一个限制为一轮感染。然而,通过将所有元素组合在一起,这项工作将需要首先在更严格的生物安全级别3设施中进行,因为它可以感染人类。这将证明工程化系统工作,并且在常用的生物安全2实验室中使用安全。

结论

所有这些组分 - SARS-COV-2的合成DNA构建体,含有诱导型启动子和两个报告基因,但缺乏封套和膜蛋白,也缺乏表达膜蛋白的293人细胞系,以及在诱导型启动子的控制下编码包膜蛋白的RNA用于将细胞转染 - 聚集在一起以产生复制缺陷,更安全的SARS-COV-2,其可以由研究人员使用的常用生物安全2级实验室设施中的病毒研究。工作仍在继续完成此SARS-COV-2系统。通过工程来到这个SARS-COV-2组件系统,来自McARDLE的科学家们计划与世界各地的其他研究人员分享这个版本,因为每个人都在这部小型冠状病毒的研究。


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我们如何到达这里

我们的团队的持续工作对我们可以在大流行期间提供科学家和社区的支持产生了很大影响。从扩大制造业到投资新自动化,每一切都会有所帮助。

Promega具有历史悠久的制造试剂,测定和研究和测试病毒的仪器。当大流行于2020年开始时,我们迅速有效地回应前所未有的需求。在过去的一年中,我们对Covid-19测试的成品目录和定制产品的需求需求增加大约10倍。为了应对这些需求,我们增加了生产线。一年前,我们每周五天举行一班。目前,我们每周七天跑三个班。这种变化允许50种不同的Promega产品,以支持全球医院,临床诊断实验室和分子诊断制造商的SARS-COV-2测试。此外,我们的临床诊断材料在今天全球市场上占Covid-19 PCR测试的2/3。自2020年1月以来,Promega提供了足够的试剂,以实现全球SARS-COV-2的估计7亿样本。

发展和进步

Promega产品用于病毒和疫苗研究。今年,我们的技术已经为几乎所有的大流行反应而杠杆化理解SARS-COV-2到测试调研学习看着疫苗反应。

Promega产品:Lumit™DX SARS-COV-2免疫测定

谁在这里让我们

我们非常感谢我们的员工。在过去的一年里,我们雇用了100多人,今天仍有职位。虽然欢迎新人,但这种具有挑战性的一年也加强了我们的协作文化的重要性。Promega的关系已经建成多年。我们团队的悠久历史使我们能够在整个全球客户的优先考虑产品分销时保持协调。它还导致与同事和供应商有效沟通。例如,领导我们的制造业务团队的平均计划为15年。他们通过具有挑战性的情况合作的历史可以帮助他们快速关注最需要的地方。

我们的600名现场员工支持产品制造,质量和研发。他们通过社会疏远,戴着面具,工作分裂偏移和限制建筑物之间的运动来剩下携带苍白的携带诉讼。虽然我们继续练习实际安全预防措施,但我们还优先考虑员工的心理健康和健康。Promega提供各种健康资源包括电话和视频心理健康会议,虚拟健身和营养类,以及压力和焦虑工具。

什么是要来

虽然我们承认Covid-19没有结束,但我们为我们能够为迄今为止与Covid-19无关的关键研究工作的支持,我们为客户提供的支持感到自豪。我们的长期规划和投资未来的政策使我们能够快速而创造性地回应并从经验中学习。


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