NanobRet™测定分析病毒:宿主蛋白质:细节蛋白质相互作用

最近,戈登等等。公布了蛋白质的图谱:所有提出的SARS-COV-2蛋白的蛋白质相互作用在HEK 293细胞中单独表达(表1)。该研究用表位标签标记了每个病毒蛋白,并进行表达蛋白的下拉,然后进行胰蛋白酶消化和质量规范分析,该方法称为亲和纯化质谱分析。该组鉴定了332例人蛋白与27个SARS-COV-2蛋白相互作用。

在hek293细胞中鉴定的相互作用帮助了Appelberg等等。分析sars - cov -2感染Huh7细胞随时间的相互作用。戈登等等。使用PPI数据鉴定FDA批准的药物,临床试验中的药物,以及与纽约和巴黎的鉴定的人类蛋白质和实验室结合的临床前化合物测试了一些这些药物用于抗病毒作用。

表格1。鉴定的人类蛋白质的一般功能区域与戈登报道的单独表达SARS-COV-2蛋白相互作用,。(1). SARS-CoV-2蛋白分为非结构蛋白(nsp#)、结构蛋白(E、M、N)和辅助蛋白(orf#)。
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冠状病毒研究中测量荧光素酶标记的报告伪型病毒颗粒的选择

冠状病毒(CoV)研究人员正在快速研究SARS-CoV-2进入细胞的原因。冠状病毒表面的Spike或S蛋白是三聚体。单体由S1和S2域组成。S1和S2的分裂在病毒产生细胞中通过两个结构域之间的furin分裂位点发生。三聚体与细胞表面蛋白质结合。在sars冠状病毒中,受体是血管紧张素转换酶2。(ACE2)。MERS-CoV利用细胞表面二肽基肽酶IV蛋白。SARS-CoV-2也使用ACE2。内化的S蛋白经过宿主细胞蛋白酶的第二次切割,位于S1/S2切割位点S2 '附近,这导致了构象的剧烈变化,被认为有助于膜融合和病毒进入细胞(1)。

CDC / Alissa Eckert,MS;丹希格斯,妈妈

研究人员没有直接与病毒打交道,而是选择制造假病毒颗粒。拟型病毒颗粒含有已知亲本病毒的包膜蛋白(例如囊泡口腔炎病毒与天然宿主细胞结合蛋白(例如(糖蛋白G)交换了病毒的宿主细胞结合蛋白(S蛋白)。拟型病毒颗粒通常携带报告质粒,最常见的是萤火虫荧光素酶(FLuc),并携带必要的遗传元件包装在颗粒中。

为了制造假病毒颗粒,只将质粒或RNA转染到细胞中,假病毒通过内质网和高尔基体从细胞中萌发到培养基中。假病毒是用来研究病毒通过交换蛋白进入的过程,从病毒感兴趣。入口通过记者的分析进行监控。报告者可能是荧光素酶或荧光蛋白。

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瑞德西韦治疗SARS-2-CoV (2019-nCoV)的可行性研究

Remdesivir (RDV或gs - 5734)是用于治疗的第一例SARS-CoV-2(前2019 - ncov)在美国(1)RDV不是一个在任何国家批准的药物,但是已经被全球许多机构请求帮助抗击SARS-CoV-2病毒(2)。RDV是腺嘌呤核苷一磷酸模拟演示抑制埃博拉病毒复制(3)。RDV在细胞内被生物激活为三磷酸形式,并作为复制必需的RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)的替代底物。掺入类似物的结果在早期终止引物延伸产物导致抑制。

注意装饰病毒外表面的尖峰,这在显微镜上观察电子时赋予病毒群岛周围的电晕的外观。在该视图中,蛋白质颗粒E,S,M和He也位于颗粒的外表面上,也已被标记。新型冠状病毒病毒被确定为2019年在中国武汉首次检测到呼吸道疾病爆发的原因。
这张由美国疾病控制和预防中心(CDC)制作的插图揭示了冠状病毒的超微结构形态。图片来源:Alissa Eckert, MS;丹·希金斯,疾病控制中心主任

为什么对RDV的所有兴趣作为SARS-COV-2的治疗?在RDV的大部分兴趣是由于北卡罗来纳大学(Ralph S. Baric)和Villbilit大学医疗中心(Mark R. Denison的实验室)合作进行了一系列研究,与Gilead Sciences合作。

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VIAFECT™试剂:在困难细胞中建立测定

转染有时看起来更像是一门艺术而不是科学——完美的转染实验依赖于条件的优化,包括细胞密度、转染试剂和DNA试剂比。没有一种试剂对每一种细胞类型都是完美的,因此在你选择的细胞系中优化性能是一个额外的挑战,这可能属于大量的“难以转染”的种类,包括许多原代细胞。

在转染试剂中,Lipofectamine®(Thermofisher)和FuGENE®(Promega)是受欢迎和广泛使用的选择。Viafect™转染试剂是一种较新的、不太知名的试剂,但作为一种高性能、低毒性的试剂,在广泛的细胞系中表现良好,已获得广泛的欢迎。在与FuGENE和Lipofectamine的面对面比较中,Viafect在转染报告基因的表达和细胞活力方面优于或等同于其他基因(见这篇文章)。

ViaFect的故事始于Promega自定义分析服务(CAS),这是一个使用Promega技术构建定制分析的团队,通常是在一个细胞系中。CAS小组的许多项目涉及到用表达载体和报告载体转染细胞。在某些情况下,客户在尝试和失败后,或者自己在建立测定方法时遇到困难,就会联系CAS,要求对一个困难的细胞系进行测定。

CAS项目在致脉冲转染之前从概念验证实验开始,然后继续生产克隆,稳定的细胞系。对于困难的细胞系,CAS组在耗尽脂质的转染选项后,先前转向电穿孔。电穿孔经常工作,但成功具有价格 - 细胞毒性。CAS组挑战R&D以找到更好的解决方案 - 更好地转染,对难以使用的细胞进行低毒性。该挑战的结果是VIAFect™转染试剂。继续阅读“VIAFECT™试剂:在困难细胞中建立测定”

闪亮的星星:Cool NanoLuc®质粒构建可通过Addgene库

自从有质粒可共享以来,研究人员就一直在共享质粒。当我还在实验室的时候,如果你读了一篇论文,看到了一个你想要使用的有趣的结构,你可以自己做,也可以“通过电话克隆”。我的一位教授在电话克隆方面非常出色,他在世界各地的实验室都有实验室,他有获得他想要的质粒的具体策略和战术。Addgene使得从一个实验室到另一个实验室共享你的结构变得非常容易。Promega支持Addgene的使命声明:通过改善对有用的研究材料和信息的访问来加速研究和发现。我们的许多技术平台都喜欢HaloTag®融合蛋白,密码子优化的萤火虫荧光素酶基因(例如,luc2),NanoLuc®荧光素酶存在于存储库中。我们鼓励人们去Addgene获取新的创新工具。毕竟,当我们分享的时候,科学不是更好吗?

我想专注于基于Addgene系列的一些工具NanoLuc®荧光素酶(nluc)。Nanoluc®Luciferase和最佳底物呋喃嗪的创建是一个很好的故事(1)。从深海虾到一个小型的生物发光的电源室,Nluc比我们更常见的萤火虫(Fluc)和更常见的荧光素酶更亮Renilla.(Rluc)荧光素酶。这对您能够做出反应的光明来说,这不是很重要,但是对于您能够做出反应的敏感性。Nluc需要100倍较少的蛋白质,以产生与Fluc或Rluc反应相同的光量。Nluc让您在生理浓度下工作。Nluc足以检测通过CRISPR / CAS9敲入产生的内源标记基因。Nluc非常邀请内源性标记,因为它只是19kda。一个例子是Crispaint-nluc构建体(质粒#67178)用于Schmid-Burgk, J.L.(2)。

Nanoluc®技术的两种应用引起了我的注意,通过将荧光素酶与荧光蛋白联接,以使成像记者和生物传感器更好。继续阅读“闪亮的星星:通过Addgene Repository提供的CoolNanoluc®质粒构建体”

制作BRET体内成像的明亮选择:使用荧光蛋白受体的Nanoluc®Luciferase

13305818-CR-DA-NANOUC-APPLICAP_LIGUND体内成像的活体是一个常见而有用的研究工具,但目前的工具可能会更好。两篇论文讨论了与生物发光反应的低背景结合荧光亮度的BRET技术的适应,以在体内成像能力中产生增强。

关键是成像波长在600nm以上的光子,因为较低的波长被含有血红素的蛋白质吸收(Chu, J.,。,2016)。荧光蛋白在体内使用是有限的,因为蛋白质必须由外部光源激发,从而产生自发荧光并且由于组织的吸收而具有有限的渗透。生物发光成像仍然是溶液,特别是萤火虫荧光素酶(37℃的612nm发射),但其使用通常需要长图像采集时间。其他荧光素,如纳米,雷农和高斯等。无需产生足够的光或者波长被组织易于吸收,限制它们对近表面成像。

这里讨论的两篇论文说明了研究人员如何组合Nanoluc®Luciferase.与荧光蛋白利用生物荧光共振能量转移(BRET),更明亮的体内成像报告。继续阅读“制作BRET体内成像的明亮选择:使用荧光蛋白受体的Nanoluc®Luciferase”

从FRET开关到BRET:Nanoluc®荧光素酶与荧光蛋白受体的应用,用于感测细胞事件

一个发光的选择

荧光共振能量转移(FRET)探针或传感器通常用于测量蜂窝事件。探针通常具有由配体结合或响应蛋白结构域连接的匹配的一对荧光蛋白。响应域中的变化反映在构象变化中,使两个荧光蛋白一起带到一起或使它们分开。通过将最蓝色移位的荧光蛋白击中其激发波长(供体)来测量传感器。所得发射转移到该对中最红移的荧光蛋白,结果最终从红移蛋白(受体)排放。

正如作者所指出的aper,s.j.a.下面,FRET传感器面临光博的挑战,自发荧光,以及令人兴奋的青色兴奋捐赠者,光毒性。使用FRET传感器的另一个挑战来临时采用光学调节器启动您希望监控的活动。光学调节剂响应特定波长并启动信号传导。当FRET供体激发与光学发起波长重叠时,挑战是挑战。研究人员试图通过交换生物发光供体的荧光供体来缓解许多这些挑战,使得生物发光共振能量转移(BRET)探针。在下面描述的三篇论文中,作者选择了NanoLuc®荧光素酶由于其极亮的信号引起的布雷特捐赠者。继续阅读“从FRET开关到BRET:Nanoluc®荧光素酶与荧光蛋白受体的应用,用于传感蜂窝事件”

探测RGS:Gα蛋白质与纳米蛋白分析相互作用

gpcr_in_membrane_on_white2当我在德克萨斯西南大学做博士后的时候,我有幸与两位诺贝尔奖得主交流,Johann Deisenhofer和Fred Gilman。有一次,我住的那栋楼停电了,约翰帮我把零下80°C的冰箱搬进了他的实验室。有一次,我在一个小型的教员联谊会上代替了我的老板,请了一位特邀演讲者,还和弗雷德·吉尔曼(Fred Gilman)和其他几位来自全校的教员喝了一杯。在教员中,有一位教授的腰带上挂着一部手机,这在1995年是一种奇怪的景象。弗雷德·吉尔曼问他那是什么,为什么会有。这样,他的实验室就可以随时通知他结果。弗雷德笑着告诉他把它扔掉——如果这是好的数据,它可以保存到明天早上。

当我读到博德尔(Bodle, C.R.)最近的一篇论文时,想起了这个故事(1)关于NanoBiT®互补分析的开发(2)测量细胞中G蛋白信号调节因子(RGS)与Gα蛋白的相互作用。(弗雷德·吉尔曼是第一个分离出G蛋白的人,这使他成为1994年诺贝尔奖的共同获得者)。作者创造了超过12个NanoBiT Gα:RGS结构域对,并发现它们可以根据细胞内相互作用的速度对不同的RGS蛋白进行分类。由于Z '因子超过0.5,这些相互作用与已知抑制剂是可逆的,适合于高通量筛选。该研究为进一步识别广谱RGS域:Gα抑制剂甚至RGS域特异性抑制剂奠定了基础。这是第二篇将NanoBiT技术应用于GPCR研究的论文(3)。

一点背景......
GPCR的主要功能是通过与细胞内异抗体G蛋白偶联通过血浆膜过细胞外信号的透射细胞外信号。受体刺激后,Gα亚基离解离βγ亚基,开始改变转录(4)的下游第二信使途径的级联。Gα亚基实际上是慢gtpases,当GTP被绑定时传播信号,但是当GTP切割到GDP时,在GTP时与βγ亚基进行关闭并重新分配。该激活过程称为GTP酶循环。G蛋白是极其慢的GTP酶。继续阅读“探测RGS:Gα蛋白质与纳米蛋白分析相互作用”

使用NanoBiT™技术设计的大麻素受体激动剂的生物测定

大麻素。这些是什么?有时,维基百科可以给出一个很好的定义:

四氢环酚(THC),CB1和CB2大麻素受体的部分激动剂。维基百科公开
四氢环酚(THC),CB1和CB2大麻素受体的部分激动剂。维基百科公开

大麻素是一类不同的化学化合物之一,它起到大麻素受体中,在大脑中改变神经递质释放的细胞中。这些受体蛋白的配体包括内胆碱(通过动物天然生产),植物植物植物(发现大麻还有一些其他植物)和合成大麻素(人工制造)。

合成大麻素(SCS)最初是为两个大麻素受体,CB1和CB2的科学调查创建,但已向街道作为大麻的“安全”和“法律”替代品。

问题是,这些SCs与大麻素受体的接触比任何从大麻中提取的东西都更彻底,亲和力更高。因此,SCs会产生严重的副作用,通常需要医疗护理。事实上,与使用大麻等天然大麻素来源相比,使用SC后寻求紧急医疗救助的可能性要高出30倍。继续阅读“大麻素受体激动剂的生物测定者设计的Nanobit™Techology”

ViaFect™试剂用于转染ipsc来源的细胞系

威斯康星州的麦迪逊是Promega的故乡,虽然它不是一个大城市,但麦迪逊是许多生物技术公司的故乡,这些公司主要由当地的世界级的威斯康星大学麦迪逊分校提供资金。许多科学家和科学家家庭在这里工作、生活和玩耍。来自不同公司的两名科学家相互交谈,发现各自公司的产品或流程对双方都有利,这种情况并不少见。

案例分数:Promega的科学家与良好的工作关系细胞动力学国际(CDI)是一家专业从事分化的IPSC衍生细胞的生物技术公司。我们希望证明我们在IPSC细胞和CDI中的测定工作希望展示可以用IPSC衍生的细胞进行的测定范围。

分化的诱导多能干细胞与原代细胞非常接近,而原代细胞因其缓慢的生长速度和增加的死亡倾向而臭名昭著的难以转染。CDI报告了巨大的成功VIAFECT™试剂并与我们慷慨地分享了他们的数据(见图)。继续阅读“VIAFECT™试剂用于转染IPSC衍生的细胞系”