使用NanoBiT™技术设计的大麻素受体激动剂的生物测定

大麻素。这些是什么?有时,维基百科可以给出一个很好的定义:

四氢环酚(THC),CB1和CB2大麻素受体的部分激动剂。维基百科公开
四氢环酚(THC),CB1和CB2大麻素受体的部分激动剂。维基百科公开

大麻素是一类不同的化学化合物之一,它起到大麻素受体中,在大脑中改变神经递质释放的细胞中。这些受体蛋白的配体包括内胆碱(通过动物天然生产),植物植物植物(发现大麻还有一些其他植物)和合成大麻素(人工制造)。

合成大麻素(SCS)最初是为两个大麻素受体,CB1和CB2的科学调查创建,但已向街道作为大麻的“安全”和“法律”替代品。

问题是,这些SCs与大麻素受体的接触比任何从大麻中提取的东西都更彻底,亲和力更高。因此,SCs会产生严重的副作用,通常需要医疗护理。事实上,与使用大麻等天然大麻素来源相比,使用SC后寻求紧急医疗救助的可能性要高出30倍。

合成大麻素JWH-018,CB1和CB2大麻素受体的全激动剂。维基百科公开
合成大麻素JWH-018,CB1和CB2大麻素受体的全激动剂。维基百科公开

SCs是欧盟新精神活性物质早期预警系统目前在欧洲监测的最大的一组化合物。全球各地的监管机构都在关注SCs的增加,并开始将非法物质的定义从基于化学结构的描述转向更多基于生物活动的定义。

需要进行测定以提供生物活性的评估,并且在最近公认的出版物中,来自毒理学实验室(根特大学,比利时)和法医毒理学实验室(德国弗赖堡大学)的研究人员正在合作开发生物带来概况合成大麻素的活性及其在大麻素受体上的代谢物(1)。

CB1和CB2是与G0 / I.蛋白质,留下许多可用于产生生物测定的选择,例如聚焦来自细胞表面的受体的内化,GTP由G的结合0 / I.蛋白质或营地和加州的变化2+。评估的每种方法都有缺点,过度劳动,或者通过测试化合物或需要专用设备或使用放射性的荧光干扰。作者提供了广泛地讨论了各种市售系统的优缺点,以监测GPCR活化。

最终的测定使用该设计NanoLuc®二元技术(Nanobit™)(2)。作者喜欢系统提供的灵活性,简单性和灵敏度。这nanobit™测定是由大亚基(17.6KDA或LGBit)和小亚基(11AA或SMBit)组成的蛋白质互补测定。LGBit和SMBET与相互作用的蛋白质融合,如果这两种蛋白质相互作用,则LGBit和SMBit汇集在一起​​以改变活性Nanobit™荧光素酶。LGBit和SMBIT的亲和力被设计为低,以便真正需要将它们带到一起的绑定伙伴。

作者在两种受体的C末端测试了LGBit和SMIT,以及β-ARRESTIN 2的N-和C-末端的相应的SMBIT和LGBET寻找最佳组合。β-arrard in 2与许多GPCR受体相互作用以使受体内化并脱敏细胞。Cb1受体测定最佳用Lgbit在β-arceptin的N-末端的SMBIT中与SMBIN结合使用。CB2受体在β-β-末端与Lgbit配对的C-末端的SMBit工作。逮捕2。

用于监测通过蛋白质结构互补的蛋白质结构互补的两个构造,与Nanobit TM系统,SMBit(11AA)和LGBit(156AA)的两种组分进行蛋白质结构互补。大麻素受体与β-instrin2的相互作用促进了SMBIT和LGBit的相互作用形成活性Nanobit TM Luciferase。CB1-LGBit:C末端LGBit融合的CB1大麻素受体。CB2-SMBIT:C-Termin SMBit融合的CB2大麻素受体。SMBIT-βARR2:SMIT融合到β-ARRESTIN2的N-末端2。Lgbit-βArr2:Lgbit融合到β-inscrectin2的N-末端。

Nanobit™测定容易监测产生EC的激动剂活动50.符合天然和合成大麻素的文献值的价值。该测定还可以评估Sc代谢物的生物活性并测量受体拮抗剂的影响。作者很高兴地报告他们可以用人源尿液样品进行Nanobit™测定,并在0-120分钟内使用非裂解测定从添加测试化合物时开始。作者的结论是,在未来,该测定可以用作SCS的第一线筛选工具。

  1. Cannaert,A。。(2016)具有新开发的生物测定的合成安制蛋白和代谢物的检测和活性分析。分析化学。10月25日,Epub提前印刷。
  2. 迪克森,A.S.。(2016)Nanoluc互补记者优化,用于精确测量细胞中蛋白质相互作用。ACS Chem。BIOL。11.,400-8。

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凯尔箍

前技术服务科学家凯尔还与产品开发的研发合作,现在专注于支持北美的Promega蜂窝分析产品。

2评论

  1. 亲爱的凯尔,

    感谢您提供这篇关于我使用NanoBiT系统的文章。一个小提示,CB2受体测量β-阻滞素2招募的最佳组合是当CB2受体连接到SmBiT,而LgBiT连接在β-阻滞素2前面。对于CB1则是相反的,正如你在文章中正确提到的那样。

    最亲切的问候,
    Annelies Cannaert.

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