选择在冠状病毒研究测量荧光素酶标记记者假型病毒颗粒

冠状病毒(冠状病毒)的研究人员迅速行动起来,了解SARS-COV-2进入细胞。一个冠状病毒的表面上的穗或S蛋白是三聚体。所述单体构成的S1和S2结构域组成。S1和S2的划分通过两个结构域之间的弗林蛋白酶切割位点发生在病毒产生细胞。三聚体结合至细胞表面蛋白。在SARS-CoV病毒的情况下,所述受体是血管紧张肽转化酶2(ACE2)。在MERS-CoV的利用细胞表面的二肽基肽酶IV的蛋白质。SARS-COV-2的用途ACE2为好。内化S蛋白推移虽然由宿主细胞蛋白酶的第二切割,称为S2'的S1 / S2裂解位点,这导致在构象的急剧变化被认为促进膜融合和病毒进入细胞(1)的附近。

CDC /阿利萨埃克特,MS;丹希金斯,MAMS

研究人员选择制造假病毒颗粒,而不是直接与病毒打交道。伪病毒颗粒含有一种知名亲本病毒(如。,水泡性口炎病毒)与天然宿主细胞结合蛋白(如。,糖蛋白G)为病毒的所研究的宿主细胞结合蛋白(S蛋白)交换。假型病毒颗粒通常携带报道质粒,最常见的萤火虫荧光素酶(Fluc的),以及必要的遗传元件被包装在颗粒中。

为了创建假病毒颗粒,质粒或RNA单独转染到细胞和假型病毒从细胞到培养基中的工作他们的方式通过内质网和高尔基体到芽。该假病毒被用于研究通过交换蛋白从感兴趣的病毒病毒进入的过程。项是通过记者的分析监测。记者可能是萤光素酶或荧光蛋白。

萤火虫荧光素酶测定

假病毒已被用于研究SARS-CoV-2 S蛋白以及其他冠状病毒的S蛋白介导的宿主细胞进入。墙壁,等。(1)选择了测量与萤火虫荧光素酶(Fluc的)报告ONE-GLO™EX萤光素酶检测系统。Letko,Marzi和明斯特(2)选择了明亮-GLO™萤光素酶检测系统。欧,等。(3)选择了Steady-Glo®荧光素酶检测系统夏,等。(4)选择原版荧光素酶检测系统。虽然每个萤火虫萤光素酶测定进行井,每个被设计为不同的应用。

夏,等。选择的原始萤光素酶测定系统,第一代萤光素酶测定。该测定法需要洗涤细胞并使用任一细胞培养裂解试剂或报告基因裂解缓冲液以产生裂解物。裂解物的一部分与萤光素酶检测试剂混合,和发光与单管的光度计测量,如GloMax®20/20仪器。从系统输出的光被极其明亮但具有<10分钟的半衰期。如果您使用的是单管发光性能的单分析,这是不是一个问题。移动到一个96孔板中需要与喷射器的板读取光度计。每个单独的井必须注射和移动到另一个井之前测量。该过程可能需要长达每平板1小时。

第二代测定法,即“Glo”测定法,是为多井板应用而设计的。这些试剂将裂解细胞和提供基质,以测量萤火虫荧光素酶。试剂被加到整个培养皿中,培养皿被一个接一个快速读取。比如乐器GloMax®发现中,整个96孔读板在约一分钟。

Steady-Glo®测定法是专为极板分批处理的超高通量应用而设计的。发光信号与1相比是相当低的ST代分析,但信号持续数小时而不是10分钟。将试剂依次添加到10s-100s的平板上,然后移到光度计上依次读取。bright - glo™检测产生与1类似的明亮发光信号ST产生测定用≥25分钟信号半衰期的附加益处。光明-GLO™检测被设计为连续的过程,其中被添加试剂,并将板移动到下一个板之前读取。一格洛™和ONE-GLO™EX试验给出一个信号半衰期明亮-GLO™和稳定-GLO™检测之间。在≥50分钟信号半衰期允许连续或小批量板的处理。所述一个-GLO™EX测定是更环境室温稳定的制剂。这些2的比较ND关于亮度和信号半衰期代萤火虫萤光素酶测定法示于图1。

图1所示。五种单辉光动力学荧光报告分析的比较。更多详细信息可在TM432。双glo®荧光素酶检测系统仅指萤火虫荧光素酶检测试剂。

海肾荧光素酶测定

假型病毒颗粒也已经产生具有海肾荧光素酶(Rluc的)记者。Pfaender,等。(6)选择了Rluc的记者为假冠状病毒生产和海肾荧光素酶检测系统用于发光测量。的海肾萤光素酶检测是第一代测定前加入测定试剂的需要裂解物的生产。该测定也低吞吐量与萤光素酶检测系统,用于测量萤火虫荧光素酶相同的限制。

A2ND代法可称为海肾-Glo™荧光素酶检测系统。这2ND生成实验将产生一个稍低的初始信号,但信号半衰期将≥60分钟。

有两种试剂可用的动力学,活细胞测量RLuc活性-EnduRen的™ViviRen™活细胞基质。两个被修改的是成为生物活化细胞内以形成腔肠素底物腔肠素的分子。既可以添加到培养液中并在任何时间适合于试剂进行测定。EnduRen的™底将产生适度的信号,但这个信号将适用于实验持续24小时。ViviRen™底会更迅速地产生一个明亮的信号,但衰减,应该使用不到1个小时的实验。

NanoLuc®荧光素酶

NanoLuc®荧光素酶是一种由深海虾分子进化而来的小酶(19kDa),当与优化的底物呋喃马嗪结合时,比FLuc或RLuc亮100倍(6)。荧光素小酶被广泛用于重组病毒的生产(7),包括MERS(8)、SARS-CoV(8)和SARS-CoV-2(9)。与nlucu - sars - cov和nlucu - mers - cov的合作提供了早期证据,表明remdesivir可能是COVID-19的一种治疗方法(10)。

Robbiani,等。(11)在洛克菲勒大学,利用一种基于艾滋病毒的病毒颗粒中的NLuc报告基因,创造了表达SARS-CoV-2 S蛋白的伪型病毒,以获得高通量应用的更高敏感性。假型NLuc病毒被用于评估100多个个体的康复血清中和抗体。洛克菲勒集团帮助了卢等。(12)表明,二聚ACE2是必要的结合上SARS-CoV的-2三聚体S蛋白。连接到IgG Fc区的两个ACE2胞外结构域可阻断的假病毒,而单体ACE2胞外结构域不能。有趣的是,在NLuc表达假研究的细胞用裂解细胞培养裂解试剂与混合前纳米glo®荧光素酶检测系统

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参考

  1. 墙壁,交流。等。(2020)结构,功能和抗原性SARS-COV-2刺突蛋白细胞181,281-292。
  1. Letko, M., Marzi, A.和Munster, V. (2020)SARS-CoV-2和其他B系betacoronavirus细胞进入和受体使用的功能评估纳特。微生物学,562-9。
  1. 或者,X。,等。(2020)SARS-CoV-2病毒进入的刺突糖蛋白的特征及其与SARS-CoV的免疫交叉反应性纳特。通讯。11,1620。
  1. 夏,S.,等。(2020)通过一个高度有效的泛冠状融合抑制剂靶向其刺突蛋白SARS-CoV的-2感染(先前2019-nCoV)的抑制该港口的高能力介导膜融合细胞研究。三十,343-55。
  1. Pfaender, S.,等人(2020)LY6E也妨碍冠状病毒融合并赋予病毒病的免疫控制bioRxiv公布2020年3月7日。
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  1. Hooper, k (2018)尺寸很重要:纳米uc®技术推进了病毒学研究
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  1. Dinnon 3,K.H.,等。(2020)小鼠适应的SARS-CoV的-2模型COVID-19的医疗对策的评价bioRxiv公布2020可7
  1. 胡珀,K。(2020)remdesivir的调查作为可能的治疗SARS-2-CoV的(2019-nCoV)。yabovipcom亚搏足彩Promega连接博客。
  1. D.F Robbiani,等。(2020)收敛抗体应答SARS-COV-2感染covalescent个人。bioRxiv发布2020可22
  1. 吕一,等。(2020)三聚的SARS-CoV-2峰与二聚的ACE2峰内活性有限相互作用bioRxiv2020年5月21日。

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凯尔·胡珀

一位前技术服务科学家,凯尔还与R&d工作了产品的开发,现在专注于支持Promega的细胞分析产品在北美。

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