为蛋白质选择标签

纯化HaloTag融合蛋白的流程图
HaloTag®哺乳动物蛋白纯化系统概述。

您已识别并克隆您的蛋白质,但您希望探索其功能。蛋白质融合标签可能有助于您的调查。但是,为蛋白质选择标签取决于您正在计划的实验。你想净化蛋白质吗?您想通过执行下拉测定来识别相互作用的蛋白质吗?您是否有兴趣检查蛋白质的内源性生物学?在这里,我们涵盖了一些蛋白质标签的优缺点,以帮助您选择最适合您需求的蛋白质。

亲和力标签

最常用的蛋白质标签属于亲和标签的范畴。这意味着标签与另一个分子或金属离子结合,使其易于纯化或拉下你感兴趣的蛋白质。在所有情况下,通过克隆到表达载体,标签将在氨基(N)或羧基(C)末端融合到你感兴趣的蛋白质上。这种蛋白质融合可以在细胞或无细胞系统中表达,这取决于载体包含的启动子。

非共价结合的标签

多亚胺6XHis标签是一个6组氨酸标签,经常用于制造融合蛋白。它的小体积不会破坏蛋白质的结构,所以你可以在其他测试中研究蛋白质。多组氨酸标签与金属离子如Ni结合2+和Zn.2+,当粗裂解液经过含有镍的树脂,结合多组氨酸标记的蛋白质时,使其易于纯化融合蛋白。与多组氨酸融合的蛋白质在细菌细胞中表达最好,因为细菌细胞中很少有来自其他蛋白质的背景结合。如果在昆虫或哺乳动物细胞中表达,则需要对金属树脂进行更严格的清洗,以去除序列中含有多组氨酸的其他蛋白质。

Glutathione-S-Transferase(GST)是另一种常用的亲和蛋白标签,用于表达蛋白质大肠杆菌从细菌裂解物中纯化标记的蛋白质。在26kda,GST比多亚氨酸和真核蛋白质大,使GST与哺乳动物或昆虫细胞一起使用。虽然较大的标签可以干扰蛋白质功能,但GST可以使融合蛋白更可溶,表达更大的水平大肠杆菌,可以一次净化更多的蛋白质。GST与谷胱甘肽结合,使用包被谷胱甘肽的珠子可以捕获并纯化融合蛋白。

标签与共价结合

尽管多组氨酸标签对金属离子有亲和力,GST对谷胱甘肽有亲和力,但它们之间的相互作用是可逆的,在进行严格的洗涤时可能会被破坏。共价键提供了一种方法,不仅可以捕获标记的蛋白质,而且它的强度意味着你可以通过严格的清洗消除背景结合。Halotag®技术是基于34kDa HaloTag®蛋白与其配体之间的共价相互作用。一旦你用HaloTag创造了N-或c -末端的融合蛋白,你就可以纯化被标记的蛋白质,跟踪它在细胞中的运动,研究蛋白质:蛋白质相互作用等等。亲和性标记在两者中都适用大肠杆菌和哺乳动物细胞。在哺乳动物细胞中表达标记的蛋白是指蛋白质将含有翻译后修饰,更准确地反映其细胞功能。此外,一旦净化蛋白质,卤素可以通过TEV蛋白酶切割除去,给您纯化,未标记的蛋白质进行分析。

生物荧光记者标签

有两种选择有生物发光标签:全长报告基因或微小肽(11个氨基酸),其在第二份互补蛋白存在下产生光。与亲和标签类似,生物发光标签与N或C末端的感兴趣蛋白质融合。但是,您可以跳过克隆步骤并添加微小hibit peptide标签使用CRISPR-Cas9基因编辑。这意味着在内源性基因上添加标签,并在细胞环境中检测你感兴趣的蛋白质。大多数标记方法使用标记蛋白的外源表达,这意味着标记蛋白在质粒中表达的水平远远高于在细胞中正常表达的水平。然而,这种更高的表达水平并不能准确反映细胞中蛋白质的数量,而且会扭曲正在研究的生物学。

此外,使用生物发光的报告者喜欢Nanoluc®Luciferase.,您可以检测来自细胞中蛋白质的光,跟踪其运动和任何易位(例如,如果含有生物发光报告者的病毒成功地感染细胞)。可以使用裂解和活细胞方法测量Nanoluc®Luciferase和Hibit标签的亮度,提供敏感的标记蛋白质。

概括

根据您的实验目标,有一种蛋白质融合标签,可帮助您的实验。无论您是寻求亲和标记还是生物化记录器,您都需要分析每个肽标签的好处,以便为您的目标选择合适的益处。

资源

想了解更多有关蛋白质标记的吗?这文章有更多的信息蛋白质标签描述在这篇文章,包括所有潜在的应用。

很好关于Halotag®技术?了解您可以使用单一融合构建体来调查蛋白质功能的所有方式在这里

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Sara Klink.

技术文件撰稿人Promega公司
萨拉是一家位于第五代奶牛场的威斯康星州,并决定成为12岁的科学家。她在威斯康星大学 - 公园旁门教育,在那里她获得了B.S.在威斯康星大学 - 麦迪逊颁发的第二阶段肿瘤学位之前,在生物学和分子生物学硕士学位。她为Promega Corporation工作了15年以上,首先是一位技术服务科学家,目前是技术作家。萨拉喜欢谈论她的娱乐鸡群,试图在规划春天的花园时不要太雄心勃勃。

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