对于成功的基于细胞分析II注意事项:细胞培养条件

这是一系列博客文章中的第二篇,这些文章涵盖了在设计和执行基于细胞的分析时需要考虑的主题。在第一期中,我们讨论了选择正确的单元格类型你的分析。这里我们将讨论细胞培养条件如何影响测定结果。

对细胞进行一致、仔细的处理对获得可靠、可重复的结果至关重要。

你的细胞培养基也许是细胞培养的最基本的组成部分。您使用的介质应是新鲜的和一致的(来自同一制造商)。因为血清补充都是复杂的生物解决方案,它们因供应商的不同而不同,甚至同一供应商的产品也不尽相同。一定要注意所有血清补充剂的批次和来源,以及用于培养用于任何实验的细胞的培养基。这将帮助您稍后复制实验,并且在将来需要进行故障排除时可能非常重要。

小心当你处理你的细胞;避免粗糙的移液。当你吸取细胞,确保悬浮培养细胞处于悬浮状态。当你胰蛋白酶贴壁细胞,不要过度胰蛋白酶化:你会杀死你的细胞。然而,如果胰酶作用不有效,最终会形成细胞团块。一个好的建议是找一个有经验的人来处理你正在使用的细胞类型。花点时间和那个人一起学习成功培养那些特殊细胞的“艺术”。当你计数细胞时,考虑使用台盼蓝排除染料除了血细胞计,这样你可以板正确数量的活细胞。

污染微生物和其他细胞系的细胞培养是细胞培养实验室关注的重点。为了避免支原体等微生物污染培养物,优良的无菌技术是必不可少的。如果你以前从未保存过细胞培养,找一个在清洁细胞培养方面声誉最好的技术人员,并向那个人学习。

细胞系的身份已被确定为一个问题在许多研究出版物,多达15 - 20%已发表的研究使用与另一个细胞系细胞被误诊或交叉污染(1),多数细胞系存储库,许多期刊和格兰特组织现在需要遗传证据表明细胞用于研究是作者声称。这种cell line身份验证通常使用STR分析来完成(1,2)。

由于数量细胞系的段落增加,细胞可能会改变字符,尤其是当细胞达到汇合,并开始看到接触抑制信令。你的分析结果可能反映了这种变化。转染细胞时,以及,你将需要考虑细胞密度和融合,如果是转染实验的过程的一部分%的汇合是一个重要的参数。一个建议是在低通道数来建立大量股票,然后解冻每个实验新的小瓶中,使通道号码对每个实验相同。

细胞密度可影响化验的结果也是如此。你需要考虑你的播种密度,并在实验时的密度是不一样的。例如,你将分发的细胞进入测定板孔中,并立即开始测定,或将细胞用于治疗或测定之前的任何时间长度进行培养?

细胞密度可以影响剂量响应曲线。在这里,我们在以三种不同密度接种的HepG2细胞中绘制了三种剂量响应曲线。HepG2细胞以每孔1000、10000或35000个细胞接种在96孔板中,暴露于不同浓度的他莫西芬4小时。采用Caspase-Glo®3/7荧光法测定Caspase-3/7活性,结果以每个细胞密度的最大信号百分比表示。所有数据点均为均值±标准差(n = 3)Riss, T.和Moravec, R.(2004)检测药物开发技术,2,51。

DRC,剂量响应曲线,基于细胞的测定法
剂量响应曲线表现出不同的细胞密度的影响。

请注意,以较低密度接种的细胞更敏感;密集的培养可能会产生一种“保护”效果。因为在较低的三苯氧胺浓度下可以观察到峰值活性,所以当使用高密度培养时,需要更长时间的接触来观察效果。此外,过度生长的培养将有更高的背景,因为细胞死亡和毒性与老化培养可能与治疗化合物的效果无关。

基于细胞的测定也有一个最佳范围细胞的数目的在其上它们将产生线性的结果。所以,当你建立一个新的实验系统,前期工作一点点走一段很长的路要走,以确保您的化验结果可靠。进行对照测定以细胞的系列稀释将帮助您确定的灵敏度和范围测定的。它也将有关电镀,治疗和测定间播种密度,和定时决定提供指导。对于多重分析或活/死测定法,你将要并行执行两个控制实验,一个用处理过的细胞,并用一个未处理的细胞。

这些是可以影响基于细胞的检测结果的细胞培养和电镀条件的一些考虑因素。在下一期中,我们将讨论治疗参数。

文献引用

  1. 邓汉姆,J.H.和Guthmiller, P.(2008)《做好的科学:细胞系身份验证》。Cell note 22, 15-17。http://www.promega.com/resources/articles/pubhub/cellnotes/doing-good-science-authenticating-cell-line-identity/
  2. 奥斯迪克,佩特森,沙加特,t和斯托茨,D.干细胞系认证和污染检测。(互联网)2009。[引:2012,01,06]。可以从http://www.promega.com/resources/articles/pubhub/enotes/stem-cell-line-authentication-and-contamination-detection/

资源
花瓣(Promega公司欧洲培训和应用实验室)课程:
从细胞培养到细胞分析
细胞培养理论与实践
多媒体:
细胞培养制备及细胞镀膜

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米歇尔是Arduengo

社交媒体经理Promega公司
米歇尔赢得了她的学士学位在生物学中的卫斯理学院她在乔治亚州的梅肯获得了BCDB的博士学位埃默里大学在佐治亚州亚特兰大。米歇尔是在Promega公司的社交媒体经理和Promega的连接博客的主编。亚搏足彩yabovipcom她喜欢迷失在一本好书,小号演奏,针织和雪鞋。

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