在研究实验室中使用更安全的SARS-COV-2

这张由美国疾病控制和预防中心(CDC)制作的插图揭示了SARS-CoV-2等冠状病毒的超微结构形态。图片来源:Alissa Eckert, MS;丹·希金斯,疾病控制中心主任
来自CDC的SARS-CoV-2图表;图片来源:Alissa Eckert, MS;丹•希金斯老妈
E =信封;m =膜

世界范围的大流行需要科学研究来了解病毒病原体。面对像SARS-CoV-2这样的新型冠状病毒,全球科学家的集中努力更加必要。然而,由于SARS-CoV-2会导致人类疾病,研究工作受到了限制,因为这些设施需要配备能够处理所需水平的物理实验室和受过处理病原体训练的人员。但是,如果我们可以绕过限制性的设施要求,设计一种合成的、有复制缺陷的SARS-CoV-2版本,让更多的研究人员可以用来研究大流行的冠状病毒,扩大测试和开发方法的能力,以减轻其对人类的毁灭性影响,那会怎么样?

挑战是开发SARS-COV-2的衍生物,反映其在细胞中的表现方式是如何妥协,使得它不能超过一段时间感染细胞。也就是说,病毒可以进入细胞或被引入细胞并重复,但无法产生传染病,如果不使用特殊的实验室设施,可以提供扩大研究能力的途径。可以创建该复制有缺陷的SARS-COV-2以编码检查其生命周期所需的基因组,而不会成为完全传染性病毒。实际上,这种复制缺陷的SARS-COV-2版本可以包括额外的遗传元素,可用于控制其表达,跟踪细胞中的病毒并测量其复制的水平。这项任务是由威斯康星大学 - 麦迪逊大学的Bill Sudgen博士进行的麦卡德尔癌症研究实验室,由研究生Rebecca Hutcheson在介绍中解释的“使病毒导致Covid-19安全研究“。

制定创建更安全病毒的策略

基于本介绍,实验室的制造SARS-COV-2的方法更广泛地用于研究,基于应用于研究人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的类似技术,导致获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)的病毒。(病毒学家喜欢他们的首字母缩略词!)特别是一种复制缺陷的SARS-COV-2,可以在普通的生物安全2级实验室中研究,更有限的生物安全级别3设施如下:

  1. 仅含有所需的遗传元件的RNA病毒的合成DNA版本。
  2. 去除负责产生可能感染更多细胞的病毒的结构蛋白的编码序列。
  3. 用报告基因替换病毒基因组的DNA版本中的结构蛋白。
  4. 使用诱导型启动子控制病毒基因组表达。
  5. 为膜和包膜结构蛋白创建单独的结构物,可添加到培养细胞中包装复制缺陷病毒。

产生合成的SARS-COV-2基因组

创建合成DNA版本的RNA病毒似乎足够简单,因为SARS-COV-2已经在识别后不久被测序并发布。通过合成病毒基因组,在创建此版本的SARS-COV-2时,不需要在任何点使用传染性病毒。相反,合成的DNA片段只需要连接在一起以创造一个全长版本的病毒。但是,这并不容易完成任务。SARS-COV-2基因组是30,000个碱基,可以产生的最长DNA片段是2,000个碱基。此外,这种合成片段需要在细菌中生长并收获以产生足够的DNA供使用。在一些情况下,合成的片段可能对细菌有毒。因此,需要时间和精力来创建一个全长合成DNA基因组的SAR-COV-2 RNA基因组,其正确地针对所需的元素,而不是野生型病毒。

从地下构建SARS-COV-2的另一个优点是用于合成所需病毒蛋白的密码子可以针对哺乳动物细胞进行优化。当使用SARS-COV-2序列时,来自McARDLE的小组花了时间来实现这一步骤。

当您可以从划痕合成DNA序列时,除去负责感染性的结构元素,并且用其他编码序列替换它们很容易。对于SARS-COV-2的30KB DNA版本,这些结构元件是包络和膜蛋白。没有构成大多数病毒颗粒外层的膜和包膜蛋白,病毒不能感染其他细胞。而不是将该空间留在DNA衍生物基因组空中,来自McARDLE的组选择以用两个报告基因取代结构编码区:NanoLuc®荧光素酶还有绿色荧光蛋白。这两种报告基因都提供了在细胞内和培养细胞培养基中检测这种修饰的SARS-CoV-2的选项,同时也提供了一种监测病毒生产的方法。Promega通过提供一个glomax®发现系统用于检测复制缺陷SARS-CoV-2 DNA构建物的荧光和发光。

压制病毒蛋白的表达

对病毒表达的另一种控制水平是需要诱导开始转录和翻译的病毒基因组的启动子。研究团队选择了人类Kox1的Krab域融合到Tet压缩机或Tet-KRAB。该蛋白质融合在细胞中组成型表达,与DNA中的TET元素结合,沉默下游的任何表达。然而,一旦添加了十二胞环素,TET-Krab不再结合并且启动子变得活性。为复制缺陷的SARS-COV-2 DNA构建体实施TET-KRAB系统。因此,当将该构建体转染到培养的细胞中时,未表达病毒蛋白,直至加入诱导症,柔软霉素。

单独表达结构蛋白

类似于其他病毒包装系统,Sudgen实验室开发了一种技术,可分别提供结构蛋白来重建传染性病毒颗粒,但是一个限制在一轮感染中。也就是说,合成病毒基因组缺乏膜和包膜蛋白,因此即使病毒在细胞内感染并重复,缺陷基因组也不能组装感染性病毒颗粒,停止随后的培养细胞的感染。使用人的293细胞系作为通过将编码蛋白质的DNA在诱导型TET-KRAB元素的控制中与细胞系基因组相接到产生膜蛋白的基础。与复制有缺陷的SARS-COV-2一样,膜蛋白只能在加入糖苷霉素时产生。使用不同的技术产生包络蛋白:RNA转染。通过将短寿命的RNA和复制缺陷的SARS-COV-2构建成293个细胞,具有集成膜蛋白,可以生产一种传染性SARS-COV-2,尽管一个限制为一轮感染。然而,通过将所有元素组合在一起,这项工作将需要首先在更严格的生物安全级别3设施中进行,因为它可以感染人类。这将证明工程化系统工作,并且在常用的生物安全2实验室中使用安全。

结论

所有这些成分——SARS-CoV-2的合成DNA结构,包含一个诱导启动子和两个报告基因,但缺乏包膜蛋白和膜蛋白,一个表达膜蛋白的293细胞系,也受诱导启动子控制,和一种编码被转染细胞的包膜蛋白的RNA一起,产生了一种复制缺陷的、更安全的SARS-CoV-2,研究人员可以利用这种病毒在大学研究校园里常见的生物安全二级实验室设施中研究该病毒。完成这一SARS-CoV-2系统的工作仍在继续。通过设计SARS-CoV-2组件系统,来自麦卡德尔的科学家计划与世界各地的其他研究人员分享这个版本,以造福所有从事这种新型冠状病毒研究的人。


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莎拉Klink

技术作家Promega Corporation
萨拉是土生土长的威斯康辛人,她在第五代奶牛场长大,12岁时就决定要成为一名科学家。她在威斯康星大学帕克赛德分校(University of Wisconsin-Parkside)接受教育,在那里她获得了生物学学士学位和分子生物学硕士学位,然后在威斯康星大学麦迪逊分校(University of Wisconsin-Madison)获得肿瘤学硕士学位。她在Promega Corporation工作超过15年,最初是技术服务科学家,现在是技术作家。萨拉喜欢谈论她那群有趣的鸡,在规划她的春季花园时尽量不要太雄心勃勃。

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