设计一种更安全的SARS-CoV-2用于研究实验室

这张由美国疾病控制和预防中心(CDC)制作的插图揭示了SARS-CoV-2等冠状病毒的超微结构形态。图片来源:Alissa Eckert, MS;丹·希金斯,疾病控制中心主任
来自CDC的SARS-CoV-2图表;图片来源:Alissa Eckert, MS;丹•希金斯老妈
E =信封;M =膜

世界范围的大流行需要科学研究来了解病毒病原体。面对像SARS-CoV-2这样的新型冠状病毒,全球科学家的集中努力更加必要。然而,由于SARS-CoV-2会导致人类疾病,研究工作受到了限制,因为这些设施需要配备能够处理所需水平的物理实验室和受过处理病原体训练的人员。但是,如果我们可以绕过限制性的设施要求,设计一种合成的、有复制缺陷的SARS-CoV-2版本,让更多的研究人员可以用来研究大流行的冠状病毒,扩大测试和开发方法的能力,以减轻其对人类的毁灭性影响,那会怎么样?

目前的挑战是开发一种SARS-CoV-2的衍生物,这种衍生物可以反映SARS-CoV-2在细胞内的行为,但受到损害,不能感染细胞超过一次。也就是说,病毒可以进入细胞或被引入细胞并进行复制,但不能产生传染性病毒,这将为扩大研究能力提供一条途径,无需使用特殊的实验室设施。这种复制缺陷型SARS-CoV-2可以在不成为完全传染性病毒的情况下,对其生命周期所需的基因组进行编码,数量不限。事实上,这种复制缺陷版本的SARS-CoV-2可能包含额外的遗传元件,可用于控制其表达、在细胞中追踪病毒并测量其复制水平。这项任务由威斯康星大学麦迪逊分校(University of Wisconsin-Madison)的比尔·苏德根(Bill Sudgen)博士的团队承担麦卡德尔癌症研究实验室,由研究生丽贝卡·哈奇森在她的报告中解释。确保COVID-19病毒的研究安全性”。

制定创建更安全病毒的策略

基于此报告,该实验室使SARS-CoV-2更广泛地用于研究的方法是基于用于研究导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的类似技术。(病毒学家喜欢他们的缩写!)具体来说,一种复制缺陷的SARS-CoV-2可在普通的2级生物安全实验室与更有限的3级生物安全设施中进行研究,其设计如下:

  1. 制造只含有所需基因元件的RNA病毒的合成DNA版本。
  2. 去除负责产生能感染更多细胞的病毒的结构蛋白的编码序列。
  3. 用报告基因替换病毒基因组DNA版本中的结构蛋白。
  4. 使用可诱导启动子控制病毒基因组表达。
  5. 为膜和包膜结构蛋白创建单独的结构物,可添加到培养细胞中包装复制缺陷病毒。

合成SARS-CoV-2基因组

制造一种RNA病毒的合成DNA版本似乎很简单,因为SARS-CoV-2在被鉴定后不久就被测序并发表了。通过合成病毒基因组,在制造这一版本的SARS-CoV-2时,任何时候都不需要与传染性病毒一起工作。相反,合成的DNA片段只需要连接在一起,就可以制造出病毒的全长版本。然而,这并非易事。SARS-CoV-2基因组有30,000个碱基,可生成的最长DNA片段为2,000个碱基。此外,这种合成片段需要在细菌中培养并收获,以产生足够的DNA供使用。在某些情况下,合成的片段可能对细菌有毒。因此,需要花费时间和精力来合成SARS-CoV-2 RNA基因组的全长DNA版本,以正确地编码所需的元素,而不是野生型病毒。

从头开始构建SARS-CoV-2的另一个优势是,用于合成所需病毒蛋白质的密码子可以为哺乳动物细胞优化。麦卡德尔的研究小组在研究SARS-CoV-2序列时,花了时间来实现这一步骤。

当你可以从零开始合成DNA序列时,去掉导致传染性的结构元素并用其他编码序列替换它们就很容易了。对于30kb DNA版本的SARS-CoV-2,这些结构元件是包膜蛋白和膜蛋白。没有构成病毒粒子外层的大部分细胞膜和包膜蛋白,病毒无法感染其他细胞。McArdle的研究小组选择用两个报告基因替换结构编码区,而不是让DNA衍生基因组中的这个空间空着:NanoLuc®荧光素酶还有绿色荧光蛋白。这两种报告基因都提供了在细胞内和培养细胞培养基中检测这种修饰的SARS-CoV-2的选项,同时也提供了一种监测病毒生产的方法。Promega通过提供一个GloMax®发现系统用于检测复制缺陷SARS-CoV-2 DNA构建物的荧光和发光。

抑制病毒蛋白的表达

另一种控制病毒表达的方法是为病毒基因组添加一个启动子,需要诱导它开始转录和翻译。研究小组选择了与Tet阻遏物融合的人Kox1的KRAB结构域Tet-KRAB。这种蛋白融合在细胞中组成性表达,与DNA中的tet元素结合,抑制下游的任何表达。然而,一旦加入强力霉素,Tet-KRAB就不再结合,启动子就变得活跃。采用Tet-KRAB体系构建复制缺陷SARS-CoV-2 DNA。因此,当这种结构被转染到培养的细胞中,病毒蛋白直到加入诱导剂强力霉素后才得以表达。

分离表达结构蛋白

与其他病毒包装系统类似,Sudgen实验室开发了一种技术,可以分别提供结构蛋白,以复制具有传染性的病毒粒子,但这种技术仅限于一轮感染。也就是说,合成的病毒基因组缺乏膜蛋白和包膜蛋白,所以即使病毒在细胞内感染和复制,有缺陷的基因组也不能组装出具有感染性的病毒颗粒,从而阻止随后对周围培养细胞的感染。以人293细胞系为基础,将可诱导的Tet-KRAB元件控制下的编码蛋白的DNA整合到细胞系基因组中,获得膜蛋白。与复制缺陷型SARS-CoV-2一样,膜蛋白只有在加入强力霉素后才能产生。包膜蛋白是用一种不同的技术产生的:RNA转染。通过将短寿命RNA和复制缺陷SARS-CoV-2构建物导入具有完整膜蛋白的293细胞中,可以产生传染性SARS-CoV-2,尽管仅限于一轮感染。然而,将所有因素结合在一起,这项工作首先需要在限制性更强的3级生物安全设施中进行,因为它可以感染人类。这将证明该工程系统是有效的,并且在一般可用的生物安全二级实验室中使用是安全的。

结论

所有这些成分——SARS-CoV-2的合成DNA结构,包含一个诱导启动子和两个报告基因,但缺乏包膜蛋白和膜蛋白,一个表达膜蛋白的293细胞系,也受诱导启动子控制,和一种编码被转染细胞的包膜蛋白的RNA一起,产生了一种复制缺陷的、更安全的SARS-CoV-2,研究人员可以利用这种病毒在大学研究校园里常见的生物安全二级实验室设施中研究该病毒。完成这一SARS-CoV-2系统的工作仍在继续。通过设计SARS-CoV-2组件系统,来自麦卡德尔的科学家计划与世界各地的其他研究人员分享这个版本,以造福所有从事这种新型冠状病毒研究的人。


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莎拉Klink

技术作家Promega公司
萨拉是土生土长的威斯康辛人,她在第五代奶牛场长大,12岁时就决定要成为一名科学家。她在威斯康星大学帕克赛德分校(University of Wisconsin-Parkside)接受教育,在那里她获得了生物学学士学位和分子生物学硕士学位,然后在威斯康星大学麦迪逊分校(University of Wisconsin-Madison)获得肿瘤学硕士学位。她在Promega Corporation工作超过15年,最初是技术服务科学家,现在是技术作家。萨拉喜欢谈论她那群有趣的鸡,在规划她的春季花园时尽量不要太雄心勃勃。

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