对于蛋白质互补测定,设计就是一切

大多数情况下,如果不是全部,细胞内的过程涉及蛋白质 - 蛋白质相互作用,并且研究人员始终正在寻找更好的工具来调查和监控这些相互作用。一种这样的工具是蛋白质互补测定(PCA)。PCA使用报告者,如荧光素酶或荧光蛋白,分为两部分(A和B),在一起时形成活跃的报告(AB)。分裂报告器的每个部分附着在形成X-A和Y-B的一对蛋白质(x和y)中的一种。如果x和y相互作用,则α和b均匀地形成活性酶(ab),产生可以测量的发光或荧光信号。从PCA测定中读出可以帮助识别将互动的条件或因素分开。

分裂记者时的关键考虑因素是找到一个允许两部分改革为活性酶的网站,但是彼此不那么强烈地吸引,它们即使在没有相互作用的情况下也会引起信号在初级蛋白质X和Y之间。本博客将简要描述Nanoluc®荧光素酶如何分离成大而小的片段(LGBit和SMBit),该颗粒被单独优化以创建Nanobit®MaSay,并展示设计如何有助于监测蛋白质 - 蛋白质互动。

分裂Nanoluc®荧光素酶和LGBit的创建

有关Nanobit™测定的详细信息。该ACS化学生物纸是源,
有关Nanobit™测定的详细信息。该ACS化学生物纸是源,

为了基于纳米产生蛋白质互补测定,从C末端发现合适的接头位点13个氨基酸,将纳米酶分离成小(氨基酸157-169)和大片段(氨基酸1-156)。大碎片没有良好表达,并且不稳定。为了解决这个问题,碎片被诱变;16个单独的突变导致稳定,易于表达的片段,其可以与13个氨基酸C末端肽相互作用以形成活性荧光素酶。结果是片段LGBit,可溶于碎片大肠杆菌并在哺乳动物细胞中表达良好。调查了91个接头站点的细节以及创建LGBit的努力迪克森。, 出版于ACS Chem Biol.2015年11月。

设计低亲和力LGBit互动的SMBIT

LGBit和天然13个氨基酸肽,或NP,表现出明显的K.D.在900nm中,亲和力太高,与弱相互作用的蛋白质一起使用。测试NP序列的350个变体,并鉴定肽,其对LGBit的亲和力截止了5个级。一个肽114只有11个氨基酸长,具有三个氨基酸取代,并且有一个明显的kD.190μm,被称为SMBIT。(顺便说一下,一种具有更高亲和力的肽(kD.= 700pm)比识别出NP。你应该很快听到hibit!)再次,见迪克森有关完整的详细信息。

为什么要尽量减少互动伙伴的亲和力?

您不希望LGBit和SMBIT对驱动两种蛋白质的相互作用,而是希望有趣的两个蛋白的相互作用以驱动纳米杆对的相互作用。比利时的一个实验室肯定被理解,分裂记者的两部分之间的不必要的互动可能是一个问题。他们的实验都分裂Renilla.由于两个报告片段对自我助学元件的倾向,荧光素酶和分裂金星荧光蛋白患有低信号与背景比率。

亮度意味着更少

Nanobit™对彼此必须具有亲和力,并且如您所期望的,靠近是在一起驱动这两个的关键因素。纳米管的过度表达或任何互补系统,可以增加互补对的局部浓度,将它们一起驱动,增加背景并产生假阳性结果。纳米荧光素酶的亮度在此使纳米菌测定是一个优势。

因为Nanoluc®Luciferase是100x比萤火虫更亮或Renilla.荧光素酶,您需要100倍的Nanoluc以获得相当于萤火虫或萤火虫的信号Renilla.荧光素酶。同样,纳米培素蛋白相互作用测定比在室温(21℃)和37℃下分裂萤火虫荧光素酶测定比分离萤火虫蛋白酶分离。37°C的性能也归因于LGBit片段的稳定性增加。分离萤火虫荧光素酶测定比在室温下工作得多,而不是在37℃下工作。

FKBP:FRB模型系统用于用纳米培训或萤火虫荧光素酶融合构建体转染HEK293细胞。在过夜孵育细胞后用雷帕霉素处理,刺激FKBP:FRB相互作用。面板A.用雷帕霉素用雷帕霉素处理细胞,并在室温(21℃)下孵育2小时,然后用试剂加成和发光测量。面板B.在试剂加法后,将细胞在37℃下孵育,测量大约30分钟的发光。然后用30nm雷帕霉素和发光处理细胞,再监测40分钟。
FKBP:FRB模型系统用于用纳米培训或萤火虫荧光素酶融合构建体转染HEK293细胞。在过夜孵育细胞后用雷帕霉素处理,刺激FKBP:FRB相互作用。面板A.用雷帕霉素用雷帕霉素处理细胞,并在室温(21℃)下孵育2小时,然后用试剂加成和发光测量。面板B.在试剂加法后,将细胞在37℃下孵育,测量大约30分钟的发光。然后用30nm雷帕霉素和发光处理细胞,再监测40分钟。

由于纳米酚是如此亮,因此测量相互作用所需的蛋白质较少,因此,您不需要像CMV这样的强大推动者来驱动表达。因此,LGBit和SMBIT融合载体由TK启动子驱动,用于大多数哺乳动物细胞中的低水平表达,产生更可能反映真正细胞生理学的测定。

带家庭消息

纳米萤光素酶被分成两种碎片。将这些片段单独优化成LGBit和SMBit,以改善表达和低相互亲和力。亲和力是使得来自纳米管的正信号可能是真实的,而不是由于记者片段驱动相互作用。来自Nanobit的信号很明亮,需要较少的蛋白质来产生可读信号。连同,纳米靶测定的这些优化的属性允许研究人员监测活性细胞中的蛋白质相互作用,其敏感性和准确性以前尚未实现。

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凯尔箍

前技术服务科学家凯尔还与产品开发的研发合作,现在专注于支持北美的Promega蜂窝分析产品。

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