使用报告基因推进对缺氧基因调节的理解:庆祝Gregg L. Semenza博士的工作

本文由嘉宾博主Amy Landreman博士撰写,她是Promega公司的高级产品经理。

氧是动物生命所必需的。它对细胞呼吸和我们生存所需的能量(ATP)的产生至关重要。考虑到对氧气的需求,我们的身体进化出感知和适应缺氧的方式也就不足为奇了。我们可以通过产生血管内皮生长因子(VEGF)来增加新血管的生成,也可以通过增加促红细胞生成素(EPO)的水平来增加红细胞(RBC)的生成,EPO是一种在红细胞生成中起关键作用的激素。但是,我们的身体是如何感知氧含量低、提高促红细胞生长素水平、并使我们的红细胞生产进入正常状态的呢?诺贝尔奖获得者Gregg L. Semenza因其对我们理解这一过程的贡献而被授予荣誉,他的研究证明了报告基因和生物发光在基因调控研究中的价值。

报告基因和生物发光是研究基因调控的重要工具

2019年,三位研究人员,小威廉·g·凯林(William G. Kaelin Jr.)、彼得·j·拉特克利夫爵士(Sir Peter J. Ratcliffe)和格雷格·l·塞门扎(Gregg L. Semenza)获得了诺贝尔经济学奖诺贝尔生理学或医学奖获奖原因:他们发现了细胞是如何感知和适应氧气供应的。我们之前已经看了一些开创性的工作Kaelin和拉特克利夫描述与缺氧反应有关的关键蛋白质相互作用。在这里,我们将重点关注Semenza实验室所做的一些研究,这些研究建立了对关键基因组调控元件的基本理解,这些元件允许EPO和VEGF等基因在缺氧条件下上调。

这项工作需要使用基因报告器。报告基因允许假定的基因组调控区域被克隆在一个容易测量的报告蛋白前面。报告基因可以瞬间转染到目标细胞中,报告基因水平可作为目标基因表达的替代物。(了解更多关于报告基因分析的信息在这里。)

Semenza等(1991)利用当时常见的报告酶氯霉素乙酰转移酶(CAT)来了解低氧条件下EPO诱导的分子机制。通过创建一个包含EPO基因3’区的CAT报告基因,他们证明,当细胞在低氧条件下培养时,一个256bp的区域可以导致CAT报告基因的表达增加。当观察到即使整个EPO基因5’侧翼序列被删除,该基因仍然完全处于缺氧诱导状态时,这个基因组序列的重要性就变得清晰了。

在一项后续研究中,我们对这个256 bp的序列进行了功能解剖,以便更好地了解哪些基因组元素对缺氧反应至关重要(Semenza和Wang 1992)。Semenza再次转向记者分析。在这些检测中,DNA区域被切割和突变,以了解对基因调控至关重要的特定DNA序列。

因为这项工作是通过瞬时转染完成的,实验报告基因的标准化对于证明观察到的报告基因表达的变化是由DNA序列的差异引起的,而不是由像高效转染这样的差异引起的,是很重要的。Semenza使用了双重报告方法来实现这一点。CAT实验报告用组成型表达的β-半乳糖苷酶对照进行归一化。

该研究表明,在原始的256=bp序列内,50 bp的序列可以完全作为缺氧诱导增强剂。这种增强因子被Semenza称为缺氧反应元件(HRE),它结合了肝癌细胞中的几个核因子:一个是构成型的,一个是由低氧水平诱导的,因此被Semenza称为缺氧诱导因子1 (HIF-1)。

Semenza实验室的工作继续探索HIF蛋白在调节细胞对低氧反应的关键基因表达中的作用。Semenza等人(1996)描述了糖酵解酶启动子中的缺氧反应元件阿尔达,三、,Ldha,再次使用报告基因来确定在缺氧条件下调节这些基因表达所需的DNA序列。该实验室转而使用萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因来完成大部分工作。与CAT相比,这提供了一个更快、更敏感的记者选择。他们继续使用B/Gal使Fluc反应正常化。

这项工作证明了HIF-1在调节激活的关键作用艾达,三,Ldha在缺氧细胞中转录。有趣的是,68 - bp三、该序列包含三个HIF-1结合位点,是当时发现的最强大的HRE。这项工作有助于理解严重缺氧的一个主要细胞适应的分子机制:从氧化磷酸化过渡到糖酵解作为产生ATP的主要手段。

Semenza实验室的工作至今仍在继续,其中一个重点领域是更好地理解HIF-1在癌症进展中的作用。Zhang等人(2015)专门研究了HIF-1在乳腺癌进展中的作用,专注于了解肿瘤缺氧条件如何影响CD47的表达。CD47是一种细胞表面蛋白,参与维持癌症干细胞,使癌细胞避免被巨噬细胞破坏。在本研究的时候,人类基因组序列已经可用,并且在CD47基因中确定了潜在的HIF结合位点。

为了从功能上表征潜在的HRE序列,Semenza团队再次使用了双报告方法。然而,他们现在已经过渡到双荧光素酶的方法使用Fluc作为实验报告和Renilla荧光素酶作为控制正常化。这双荧光素酶报告基因检测系统可以更有效地连续测量来自同一细胞的两种报告基因,不需要像以前那样在单独的试验中分离裂解物和进行B/Gal测量。

使用这种方法,他们确定当表达在任何一种假定的CD47 HREs后,细胞缺氧增加了正常的Fluc表达。结合其他结果,作者得出结论,HIF-1直接与CD47启动子结合,激活基因转录。这项工作为乳腺癌细胞避免吞噬和肿瘤干细胞如何维持提供了机制上的见解,提示HIF抑制剂可能是一种潜在的治疗策略。

自从HREs和HIF蛋白的最初鉴定以来,Semenza实验室和其他研究人员已经了解了很多。多种形式的HIF已经被确定,HIF调控的过程已经被发现,许多基因被发现作为细胞缺氧反应的一部分被调控。我们现在对氧稳态的改变如何导致许多人类疾病有了更好的理解,提供了潜在的疾病治疗策略。这项工作的研究也证明了早期分子生物学工具在基因组分析中的重要性,以及报告物分析在基因组调控序列的功能表征中发挥的重要作用。

2021年标记30年以来,自第一个萤火虫荧光素酶载体和试剂作为研究界的产品可用。当我们庆祝这个里程碑时,回顾并看看这些工具如何使这些工具能够像Semenza博士这样的研究人员,以了解在今天继续建立在蜂窝生物学中的基本机制的重要进步。

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文献引用:

西门。(1991)。缺氧诱导核因子结合到一个增强元件定位于3 '人促红细胞生成素基因。Proc。Natl。阿卡。SCI.。88(13): 5680 - 5684。

Semenza和Wang(1992)缺氧通过从头蛋白合成诱导的核因子与人类促红细胞生成素基因增强子在转录激活所需的位点结合。摩尔细胞生物12(12): 5447 - 5454页。

西门。(1996)醛缩酶A、烯醇化酶1和乳酸脱氢酶A基因启动子中的缺氧响应元件包含缺氧诱导因子1的必要结合位点。J Biol Chem.271 (51): pp. 32529-32537。

。(2015) HIF-1调控CD47在乳腺癌细胞中的表达,促进逃避吞噬和维持肿瘤干细胞。Proc。Natl。阿卡。SCI.。112 (45) E6215-E6223。


Amy是Promega公司的高级产品经理。她的主要职责是管理生物荧光报告产品和转染产品领域的产品生命周期和新产品路线图。这份工作中她最喜欢的部分是确定科学界未被满足的需求,并在整个组织中传播这些需求,以创造有用的新产品。Amy在威斯康星大学麦迪逊分校获得植物学学士学位和分子与环境毒理学博士学位,在转换到产品技术支持和产品管理之前,她是一名应用毒理学家。


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