使用报告基因推进对缺氧基因调节的理解:庆祝Gregg L. Semenza博士的工作

这篇帖子是由Guest Blogger,Amy Landreman,Phd,Sr.Promega Corporation的产品经理编写的。

氧气是动物生活所必需的。对于我们需要生存的细胞呼吸和能量(ATP)是必不可少的。鉴于对氧气的需要,我们的身体已经发展和适应降低氧气条件(缺氧)并不令人惊讶。通过产生血管内皮生长因子(VEGF)或增加红细胞(RBC)生产来增加新血管的生产,或通过增加发挥RBC的主要作用的关键作用的激素来增加红细胞(RBC)生产。但是我们的身体感觉如何低氧气,增加EPO水平,并将我们的RBC生产踢进齿轮?诺贝尔·劳特·格雷格尔·西伦塔荣获他对我们对这一进程的理解的贡献,他的研究表明了报道基因和生物发作来研究基因调控的价值。

报告基因和生物发光是研究基因调控的重要工具

2019年,三位研究人员,小威廉·g·凯林(William G. Kaelin Jr.)、彼得·j·拉特克利夫爵士(Sir Peter J. Ratcliffe)和格雷格·l·塞门扎(Gregg L. Semenza)获得了诺贝尔经济学奖诺贝尔生理学或医学奖获奖原因:他们发现了细胞是如何感知和适应氧气供应的。我们之前已经看了一些开创性的工作Kaelin和拉特克利夫表征缺氧反应中涉及的关键蛋白质相互作用。在这里,我们将重点关注Semenza实验室的一些研究,该研究已经确定了对关键基因组调节元件的基因组调控元素,使ePO和VEGF等基因响应缺氧条件而上调。

这项工作需要使用遗传记者。记者基因允许推定的基因组调节区域在容易测量的报告蛋白前克隆。记者构建体可以瞬时转染到靶基因表达的替代物的感兴趣的靶细胞和报告水平中。(了解有关报告基因测定的更多信息这里。)

Semenza等人(1991)使用当时的氯胺酰氯乙炔转移酶(猫)酶,以了解低氧条件下EPO诱导的分子机制。通过创建包含含有EPO基因的3'区域的猫报告构建体,他们证明了256bp区域可能导致CAT报告的表达增加,当细胞在低氧条件下培养时。当观察到缺失整个EPO基因5'-侧序序列时,这种基因组序列的重要性变得清楚,因此基因保持完全缺氧诱导。

在一项后续研究中,我们对这个256 bp的序列进行了功能解剖,以便更好地了解哪些基因组元素对缺氧反应至关重要(Semenza和Wang 1992)。Semenza再次转向记者分析。在这些检测中,DNA区域被切割和突变,以了解对基因调控至关重要的特定DNA序列。

由于这项工作是通过瞬时转染完成的,实验记者的正常化对于证明观察到的报告表达的变化是由DNA序列的差异引起的,而不是有效地转染的情况。Semenza使用了一种双重记者方法来实现这一目标。通过组成型表达的β-半乳糖苷酶对照,猫实验记者归一化。

这项工作证明,在原始256 = BP序列中,50-BP序列可以作为缺氧诱导的增强剂完全正常。Semenga被称为缺氧响应因素(HRE)的增强剂,在肝癌细胞中结合了几个核因子:由本构成的核因子,并且由低氧水平诱导的核因子,因此称为缺氧诱导因子1(HIF-1)由Semenza。

Semenza实验室的工作继续探索HIF蛋白在调节细胞对低氧反应的关键基因表达中的作用。Semenza等人(1996)描述了糖酵解酶启动子中的缺氧反应元件阿尔达eno1., 和Ldha,再次使用报告基因确定调节在缺氧条件下这些基因表达所需的DNA序列。该实验室转型至使用萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因大部分工作。与猫相比,这提供了更快,更敏感的报告选择。他们继续使用B / GAL进行血管反应的标准化。

这项工作证明了HIF-1在调节激活的关键作用Alda,Eno1., 和Ldha缺氧细胞转录。有趣的是,68磅eno1.含有三个HIF-1结合位点的序列是当时确定的最强大的HRE。这项工作有助于了解严重缺氧的一个主要细胞适应后的分子机制:从氧化磷酸化到糖溶解的转变为产生ATP的主要方法。

今天的研讨会的工作继续,一个焦点领域更好地了解HIF-1在癌症进展中的作用。张等人(2015年)特别是HIF-1在乳腺癌进展中的作用,重点是了解肿瘤患者CD47的肿瘤抗冲表达的缺氧情况。CD47是一种细胞表面蛋白,其参与维持癌症干细胞并使癌细胞能够避免巨噬细胞破坏。在本研究的时候,现在可获得人类基因组序列,并且在CD47基因中鉴定出潜在的HIF结合位点。

在功能性地表征潜在的HRE序列,Semenza团队再次使用双重记者方法。然而,它们现在已经过渡到使用Fluc作为实验记者的双荧光素酶方法和Renilla荧光素酶作为控制正常化。这双荧光素酶报告基因检测系统可以更有效地连续测量来自同一细胞的两种报告基因,不需要像以前那样在单独的试验中分离裂解物和进行B/Gal测量。

使用这种方法,当表达推定的CD47 HRES后面时,它们确定细胞缺氧增加了标准化的血丝表达。作者结束了其他结果,总结了HIF-1直接与CD47启动子结合以激活基因转录。这项工作提供了机械洞察力,乳腺癌细胞可以避免吞噬作用以及如何维持癌症,这表明HIF抑制剂可能是潜在的治疗策略。

Semenza实验室和其他人已经学习了很多,因为原来的HRES和HIF蛋白的鉴定。已经表征了多种形式的HIF,已经发现了HIF调节的方法,并且已经发现许多基因被调节为细胞缺氧反应的一部分。我们现在更好地了解氧气稳态的变化如何导致许多人类疾病,提供潜在的疾病治疗策略。本作研究的研究还表明早期分子生物学工具在基因组分析中的重要性,并且在基因组调控序列的功能表征中发挥了重要作用。

2021年标记30年以来,自第一个萤火虫荧光素酶载体和试剂作为研究界的产品可用。当我们庆祝这个里程碑时,回顾并看看这些工具如何使这些工具能够像Semenza博士这样的研究人员,以了解在今天继续建立在蜂窝生物学中的基本机制的重要进步。

30年的Glo-ing:庆祝生物发光的应用,包括报告基因测定

要了解有关过去30年的生物发光创新和他们启用的发现,请访问我们的30周年庆典页面


文献引用:

西门。(1991)。缺氧诱导核因子结合到一个增强元件定位于3 '人促红细胞生成素基因。Proc。Natl。阿卡。SCI.。88(13):5680-5684。

Semenza和Wang(1992)缺氧通过De Novo蛋白合成诱导的核因子与转录激活所需的位点的人促红细胞生成素基因增强子结合。摩尔细胞生物12(12):p。5447-5454。

西门。(1996)醛缩酶A、烯醇化酶1和乳酸脱氢酶A基因启动子中的缺氧响应元件包含缺氧诱导因子1的必要结合位点。J Biol Chem.271(51):PP。32529-32537。

。(2015) HIF-1调控CD47在乳腺癌细胞中的表达,促进逃避吞噬和维持肿瘤干细胞。Proc。Natl。阿卡。SCI.。112 (45) E6215-E6223。


Amy是Promega Corporation的SR.产品经理。她的主要责任正在管理生物发光记者和转染产品区域的产品生命周期和新产品路线图。她最喜欢的这份工作是在科学界内识别未满足的需求,并通过组织传达这些需求,以创建有用的新产品。艾米在威斯康星大学 - 麦迪逊大学获得了植物学和博士学位,并在威斯康星大学的分子和环境毒理学中,并在过渡之前作为应用毒理学家,以扮演产品技术支持和产品管理。


以下两个选项卡更改以下内容。
Promega产品由生活科学家使用,这些科学家们向生物过程和科学家们向诊断和治疗疾病的科学家询问生物过程和科学家,发现新的治疗方法,并使用遗传和DNA测试进行人体鉴定。最初是,在美国威斯康星州麦迪逊成立于1978年,Promega在16个国家设有分支机构,50多家全球经销商提供100个国家。

发表评论

这个网站使用Akismet来减少垃圾邮件。了解如何处理评论数据