利用大规模平行测序在法医分析中的力量

下一代测序技术的快速进步,也称为大规模平行测序(MPS),已经彻底改变了许多应用研究领域。一种这样的区域,对法医应用中的线粒体DNA(MTDNA)的分析传统上使用了另一种方法 - Sanger测序,然后用毛细管电泳(Ce)。

虽然MPS可以提供​​丰富的信息,但它在法医工作流程中的初始采用仍然很慢。然而,近年来,该技术采用的障碍已降低,如2018年9月举行的第29届人类识别(ISHI 29)在第29届国际研讨会上展示了MPS的摘要数量的摘要。与桑格相比测序,MPS可以提供​​更多关于人类基因组的微小变异的数据,特别是对于分析MTDNA和单核苷酸多态性(SNP)。对于分析混合物样品或DNA高度降解的那些,例如在人体中,它特别强大。

尽管存在这些优势,但法医分析中的MPS广泛采用仍面临一些挑战。实验室必须适应完全不同的技术,这需要专门的培训,并且必须对案例作出验证方法。与CE分析中获得的相对简单的结果(电动图)相比,MPS数据的软件分析可以复杂。另外,对于MPS而不是对于CE来说,每个样本的成本仍然更高。最后,对MPS的库制剂可以是耗时的并且涉及多种酶处理和纯化步骤。标准CE工作流中不需要这些步骤。

为了简化标准MPS工作流程,Promega开发了Powersq™CRM嵌套系统,自定义(猫。#AX5810)。该系统产生覆盖人体线粒体基因组中的控制区域或“D环”的10个小型扩增子。该系统使用单复用扩增反应来通过使用含有Illumina®适配器序列的嵌套底漆组来产生测序就绪库。内底漆退火到MTDNA模板中以扩增靶序列。指数引物退火到扩增产物,在放大期间增加了独特的指标。扩增子的大小范围为144至237 BP,这种小尺寸使系统成为分析降解的DNA样品的理想选择。可以在任何Illumina®Miseq®系统或兼容仪器上进行测序所得到的库。

Powerseq™CRM工作流程
Powersq™CRM工作流程结合了MTDNA基因座扩增和添加测序适配器。

嵌套放大过程包含在Powerseq TM CRM嵌套系统中,定制导动时间为一个样品节省至少1小时,持续九十六个样品超过3小时。经过时间的节省范围从三到近五个小时。与嵌套工作流程制备的样品在两天内的标准PowerseQ™工作流程,可以在一天内准备好排序。需要更少的样品操作步骤,从而降低引入DNA污染或混合样品的风险。

在ISHI 29,萨钦信仰,博士,介绍了一项研究的结果,以优化和验证Powersiq™CRM嵌套系统,定制,以获得法医分析。该研究是通过信心小组在Battelle(哥伦布,俄亥俄州)和俄亥俄州刑事调查局的群体进行的。它们从几种样品类型中提取DNA,包括人体骨骼,牙齿和颊拭子,并使用PowersQ TM CRM嵌套系统,定制扩增MTDNA法医基因座并制备测序文库。在清理PCR扩增子后,合并24个分量样品并使用2×300 BP配对盖读数在Illumina®Miseq®系统上进行测序。使用Genemarker®HTS软件(SoftGenetics,Pennsylvania)进行生物信息分析。还由所提供的2800M控制DNA和标准参考材料(SRM)2392 DNA制备文库,验证对PCR的MTDNA法医分析进行了验证的对照。对应于对应于10-100,000拷贝的MTDNA的稀释液中使用控制DNA样品。

对于对照样品,测序数据在对应于10份MTDNA拷贝的稀释度下显示出良好的覆盖率(100x)。对于骨骼样品,在不同的变体位置获得均匀的覆盖,其中输入DNA为100,1,000和10,000份MTDNA。获得从骨,牙齿,颊拭子拭子和对照中提取的DNA获得全对照区域单倍型。分析还显示出与MTDNA控制区域的Sanger测序数据具有优异的一致性。

在他的介绍中,信仰强调使用MTDNA特异性定量方法来准确测定输入DNA量的重要性,以及运行重复的PCR,以确认在降解样品中的DNA损伤的变体。他还推荐使用对MTDNA扩增和测序的阴性和阳性对照。

总之,Powersq™CRM嵌套系统,通过MPS对人类MTDNA的高敏感性变异分析进行了定制的高效库。该系统应使法医实验室能够为MTDNA分析开发更有效和成本效益的工作流程,特别是在使用降级的样品时。

以下两个选项卡更改以下内容。
Ken是Promega Corporation的一位科学作家。虽然他的博士学位在分子生物学中,但他喜欢从M-Dighere到Graptolites的一切研究和写作。当他没有与家人共度时光或服务他的犬和猫牧师时,肯参与了一个神话般的生物,称为“业余时间”。如果他成功,他希望恢复写作小说,所以他可以保持平衡的大脑。

肯多伊尔的最新帖子查看全部

发表评论

本网站使用AkisMet减少垃圾邮件。了解如何处理评论数据