提高你的转染成功率

12150558——plasmid_with_cell_membrane3不是每个实验室有一个所有实验室成员使用的尝试和真正的转染协议。很少有研究者将使用相同的细胞类型和同一构造产生的数据。很多时候,科学家可能需要不同的结构或甚至不同的分子(例如,短干扰RNA [siRNA的])转染到相同的细胞系,或测试在不同的培养细胞系的单个构建体。一个构建体可以很容易地转染到多种不同的细胞系或转染协议可用于几个不同的构建工作。然而,一些细胞如原代细胞可以是难以转染和一些核酸将需要为成功的转染进行优化。这里有一些提示,可以帮助你提高你的成功转染。

转染健康,积极分裂的细胞在一致的细胞密度。转染时细胞传代数应低,融合度为50-80%。使用相同的细胞密度可以减少复制的可变性。保持细胞支原体免费确保最优增长。

使用高品质DNA转染。转染质量的DNA不含蛋白质、RNA和含A的化学物质260/一个2801.7 - -1.9的比例。在无菌水中或TE缓冲液中制备纯化DNA,最终浓度为0.2-1mg /ml。

优化用于转染细胞的DNA数量。DNA的最佳量在转染使用将广泛地变化,这取决于所使用的DNA的类型和靶细胞系。我们建议初步测试在96孔板格式每孔DNA的50-200ng。增加DNA的量并不一定导致更高的转染效率。以帮助减少毒性如果观察到,特别是在原代细胞,降低DNA浓度可能会有帮助。

优化转染试剂:DNA比对。对于许多细胞系中,为1.5比:1-4:转染试剂的1:DNA(微升试剂:微克DNA)工作良好,但比此范围之外的可以是用于特定细胞类型或应用最佳的。测试其他比例,最大限度地转染效率。转染效率可以利用与报告基因(例如,萤火虫荧光素酶)的质粒进行监测。一个理想的报告基因产物特有的细胞,可以从质粒DNA中表达并可以方便地测定。通常,这样的测定法是在转染后24-48小时进行。我们提供FuGENE®HD优化分析工作表帮助确定最佳比例时,使用FuGENE®HD转染试剂

优化转染后每孔细胞数。特定细胞系的镀层密度将取决于生长速率。一般的做法是在5×10左右制版贴壁细胞每60mm培养皿或10个6每次测定悬浮细胞。对于96孔板,我们通常建议1-2×104每孔贴壁细胞或2-10×10每孔的细胞悬浮液。如果使用不同大小的板尺度单元的数量向上或向下成比例。

确保所选择的转染试剂是用含有血清对于需要血清的细胞培养基兼容。许多转染方案需要无血清条件来达到最佳性能,因为血清会干扰许多商业上可用的转染试剂。但是,也有类似的试剂ViaFect™转染试剂可用于有血清存在的转染方案中,用于转染需要连续接触血清的细胞类型,如原代细胞培养物。

用转染试剂孵育DNA至最佳时间。许多转染试剂需要时间形成转染试剂:DNA复合物(例如,ViaFect™转染试剂在室温下5-20分钟)。不同细胞系形成复合物的最佳时间各不相同。转染细胞孵育24-48小时后进行检测,以便有时间观察转染DNA的表达。

不知道你的转染细胞系时,从哪里开始?该转染助理提供了转染的起点。只要选择的细胞系,要么FuGENE®HD转或FuGENE®6转染试剂找到同行评议的文献中使用的条件。该FuGENE®HD转染试剂协议数据库对转染的细胞系的协议。选择细胞系,所用板的类型和所转染的井的数量和协议将根据由Promega科学家测试条件来生成。

需要转染优化帮助?该PubHub文章“优化培养细胞转染”展示了如何设置和执行优化实验。

对转染还有疑问吗?我们的技术服务的科学家可以提供帮助。

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萨拉克林克

技术文件撰稿人Promega公司
萨拉是土生土长的Wisconsinite谁在第五代奶牛场长大,并决定她想在12岁。她在威斯康星柏丽,在那里她获得了学士学位的大学接受教育科学家在生物学和威斯康星 - 麦迪逊大学获得的肿瘤她的第二个硕士学位之前,分子生物学硕士学位。她已经工作了Promega公司超过15年来,第一次作为一个技术服务的科学家,目前的技术作家。萨拉喜欢谈论她的娱乐鸡和尝试不打算她春园时过于雄心勃勃的羊群。

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