NanoLuc®荧光素酶:体内成像的光明前景

纳米uc活体成像

NanoLuc®荧光素酶技术的发展,为研究者提供新的和更好的工具来研究内源性生物:蛋白质在细胞和组织内的原生环境的行为。这个小(〜19kDa)的荧光素酶的酶,从深海虾衍生Oplophorus gracilirostris,提供了几个优于萤火虫或海肾荧光素酶。对于NanoLuc®荧光素酶应用的概述,请参阅:NanoLuc®荧光素酶的权力超过报告基因分析

小尺寸NanoLuc®荧光素酶,以及缺乏对ATP的要求,以产生生物发光信号,使作为一个记者就特别有吸引力体内生物发光成像包括细胞和活体动物。作为融合蛋白的小报告分子的表达不太可能干扰目标蛋白的生物学功能。NanoLuc®二元技术(NanoBiT®)通过创建一个互补报告系统(其中一个亚基只有11个氨基酸长度)将这一方法更进一步。本视频解释了高亲和力的NanoBiT®互补(HiBiT)的工作原理:

追踪病毒的小标签

基于NanoLuc®体内成像的早期应用是病毒感染的研究。在2013年,Tran等人。报告复制能力的记者病毒的流感A(1)的小鼠模型研究的发展。以前生物发光成像技术通常导致在是不稳定的和从体内有限的灵敏度受到记者病毒。该NanoLuc®记者病毒,这是等同于天然的A型流感病毒小鼠表现出致病性和杀伤力。使用记者病毒,研究人员能够跟踪在肺部的病毒载量和传播。他们的研究结果证明在研究新出现的病毒和抗病毒治疗的潜在影响NanoLuc®记者病毒的工具。

最近的一项研究证实了一种构建报告病毒的方法,该方法进一步提高了报告病毒的稳定性,并在设计报告病毒时提供了更大的灵活性(2)。在本研究中,研究人员将HiBiT标记插入修饰过的溶瘤腺病毒基因组中,在病毒E3启动子的控制下。该启动子在感染后不久被病毒E1A蛋白激活。为了证明报告病毒的稳定性和功能,研究人员感染了表达互补LgBiT肽的贴壁和悬浮前列腺癌细胞株。他们观察到NanoBiT®荧光素酶活性在所有被测细胞系感染24小时后,使用Nano-Glo®底物成功重构。

在体内成像方面,他们监测了报告病毒对lgbit表达细胞的稳定感染,然后用报告病毒或对照组植入小鼠体内感染肿瘤。腹腔内(IP)底物管理显示成功的感染和良好的底物分布,导致持续的生物发光发射。研究人员在这些实验中使用了呋喃马嗪的衍生物(氢呋喃马嗪),因为它增加了溶解度,并且在成像所需的浓度下,可以很容易地给药。该衬底与提供更亮体内信号的氟咪嗪一起,最近被开发用于小鼠体内成像应用(3)。这些新型衬底为利用NanoLuc报告技术推进体内研究提供了新的选择。

进一步的感染动力学研究(2)表明溶瘤病毒没有到达整个肿瘤肿块;然而,这一结果与临床试验中的溶瘤腺病毒研究是一致的。这组作者的结论是,他们的方法适用于研究广泛的病毒,特别是那些不能容忍大量转基因插入的病毒。

更好的BRET:抗体-受体相互作用

利用生物发光成像实体肿瘤或其他组织的一个挑战是生物发光反应的发射波长。血红蛋白主要在可见光谱的蓝色和绿色区域吸收;因此,理想的生物发光反应会在远红色区域发光(4)。NanoLuc®荧光素酶反应在蓝色区域的460nm处发光。具有合适发射波长的荧光染料传统上用于体内成像,但受到外部激发源要求的限制。

生物发光共振能量转移(BRET)提供了最好的两个世界:小尺寸的NanoLuc®荧光素酶标签和亮度的荧光分子。在BRET中,当供体荧光素酶底物与荧光受体分子接近时,能量就会从底物转移到荧光受体分子上。然后荧光分子以自己的最佳波长重新发出光。由于NanoLuc®荧光素酶不依赖atp,它也可用于BRET应用,报告基因在细胞外表达,为研究发生在细胞表面的分子相互作用创造了新的可能性。

唐等人。用过的BRET研究治疗性抗体的结合,以在活的动物(5)受体。它们稠合NanoLuc®萤光素酶的表皮生长因子受体(EGFR)的N-末端,和所使用的荧光染料DY605共价附着于治疗性抗体西妥昔单抗作为受体。虽然除了furimazine到NanoLuc®-EGFR融合蛋白的单独导致在460nm的预期发射峰,抗体结合产生的,在为625nm的附加峰。这两个发射峰之间的间隔是足够的可靠和灵敏的检测,作为其特征在于细胞培养物。

在体内实验中,研究人员使用裸鼠肿瘤移植模型检查了西妥昔单抗的受体占用和药代动力学。他们观察到受体不完全占用,即使是在高于西妥昔单抗治疗剂量的情况下,这表明只有一小部分受体可用于抗体结合。尽管存在一些技术上的限制,BRET被证明是一种有用的、无创的成像技术来建立西妥昔单抗与EGFR结合的剂量-反应关系。作者指出,该方法可以推广到研究其他治疗性抗体的疗效和毒性。

的另一种方法是BRET融合生物发光蛋白与荧光一个。一个例子是心宿报告系统,其中,荧光素酶NanoLuc®稠合到青色激发的橙色荧光蛋白1(CY-OFP1)的两个拷贝的发展。这种方法被总结在制作BRET光明选择的体内成像:使用NanoLuc®荧光素与荧光蛋白受主。Su等人(3)使用Antares报告器和萤火虫荧光素酶报告器对小鼠的两个细胞群进行体内成像。他们能够测量肿瘤大小,也能在同一只动物中观察嵌合抗原受体(CAR) t细胞迁移。

更多关于NanoLuc®荧光素酶的体内成像应用,或查询新的检测方案,请参阅我们的NanoLuc®生物发光成像资源页面。

参考文献

  1. Tran, V.等人(2013)流感报告病毒的高灵敏度实时体内成像揭示了复制和传播的动态。j .性研究87, 13321年。
  2. Gaspar, N.等人(2020)纳米系统和氢呋喃马嗪优化小鼠病毒感染检测-一种新的体内成像平台。Int。j .摩尔。科学。21, 5863年。
  3. Su, Y.等人(2020)新型纳米uc基质使明亮的双种群生物发光成像成为可能。纳特。方法17,852-860。
  4. Zhao, H.等人(2005)生物发光报告的发射光谱和与哺乳动物组织的相互作用决定了体内检测的灵敏度。j .生物医学。光学10 (4),041210。
  5. 唐,Y等。用于确定体内抗体 - 受体占据(2019)A-基于传递生物发光共振能量的方法。iScience15,439-451。

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Ken是Promega公司的一个科普作家。虽然他的博士学位是在分子生物学,他喜欢研究和写作一切从M-理论笔石。当他不花时间与家人或他的服务犬和猫霸主,肯啮合在追求被称为“业余时间”一个神秘的生物。如果他成功了,他希望回到写小说,所以他可以保持他的大脑平衡。

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