利用预先构建的HiBiT细胞系定向蛋白降解

最近,利用细胞的天然泛素蛋白酶体途径(UPS)选择性靶向蛋白质降解已经成为一种绕过与癌症等疾病相关的难药物蛋白的有效策略。利用灵敏的生物发光技术,crispr编辑细胞系可以促进研究常用的蛋白质降解靶点。

实验室长凳和艺术家3d的妇女定向靶梢的蛋白质劣化在hibit细胞线的翻译

NanoLuc®荧光素酶(NLuc)使生物学比以往任何时候都更容易获得(1)。NLUC的进一步实验导致蛋白质互补系统的产生(2)和发现HIBIT生物发光肽的发现。HIBIT与工程化互补亚基LGBET自发地结合,得到一种称为NANBIT®LUCIFIRA酶的活性荧光素酶。

Nluc的小尺寸和极其明亮的信号允许在生理水平处研究事件。肋骨3.)的研究表明,可以通过NanoLuc®Luciferase标记的异位表达转录因子来监测应激反应转录因子稳定性的生理控制。这些关键的应激反应因子不断地被转录和翻译,使细胞能够立即对应激作出反应。

在未受压力的细胞中,这些蛋白质的水平基本上为零。这一水平是通过蛋白酶体降解E3连接酶泛素化来维持的。一旦细胞经历应激,降解信号不会发生,应激反应因子的浓度增加,允许应激反应。

应力因子控制的机制是导向靶向蛋白质降解背后的想法,其具有治疗意义的细胞蛋白质的有希望的方法。这一领域的领导者之一,耶鲁大学的克雷格船员(4.),使用靶向含嵌合或斑块的小分子被称为蛋白水解。

ProtAc是二价分子,其一端含有E3连接酶粘合剂,另一端含有由间隔物分离的靶蛋白粘合剂。将靶蛋白与E3连接酶的邻近引起普发,随后的蛋白酶体降解。已经证明了靶向蛋白质降解的其他策略(5.)。

这项工作的关键是能够将转染的NLuc融合量降低到极低水平,但仍能检测到信号。但是这些PROTACs是如何真正影响内源性蛋白质的呢?许多靶向蛋白降解工作依赖于蛋白质印迹法来跟踪目标蛋白的降解;然而,西方的整个过程可能是繁琐和耗时的。CRISPR/Cas9方法为内源性标记靶蛋白提供了一种解决方案。

由于固有的灵敏度,NLUC是CRISPR / CAS9敲入的明显选择,但HIBIT在没有克隆的情况下提供更用户友好的敲门选项(6.7.)。目标参与的五个关键方面——三元复合物形成、泛素化、蛋白酶体募集和最终降解——都可以通过内源性hibit标记的目标来完成(8.)。

异常表达的Nluc融合仍然允许详细研究靶向蛋白质降解(9.)。丰富(10.)使用内源性Hibit标记的靶标,以了解CDK2的保护依赖性降解的动力学。在本文的数据补充中,使蛋白质降解的评估比较不同地表达和内源性的Hibit标记的靶蛋白。使用内源性Hibit标记的目标,信号具有更大的动态范围。

Lim等人。(9.)实现了使用内源性Hibit标记目标但状态的优点,“虽然Hibit平台具有使用较小标签的优点并报告目标蛋白质的内源性水平,但Hibit敲击细胞系是耗时的产生。”真实的,从一池阳性细胞池到克隆细胞线是耗时的;但是,访问预构建的HIBIT标记的克隆单元线将解决时间问题。

许多内源性Hibit标记的细胞系是可用的。预建HiBiT细胞系比自定义细胞系更实惠,并有资格包含在学术访问程序。学术访问计划旨在促进在学术研究中使用Promega先进技术。


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参考

  1. 大厅,议员(2012)从深海虾的工程荧光素酶报告者利用新型咪唑吡嗪酮底物ACS Chem。BIOL。7,1848 - 57。
  2. 迪克森,A.S.(2016)Nanoluc互补记者优化了精确测量细胞中蛋白质相互作用ACS Chem。BIOL。11.,400-8。
  3. 罗伯斯,M.B.(2014)使用Nanoluc®Luciferase测量细胞内蛋白寿命动力学Promega公司
  4. 工作人员审核
  5. Klink,美国(2019年)PROTACs, PHOTACs和LYTACs:如何靶向蛋白质降解亚搏足彩
  6. ,抗议;(2018)Crispr-介导的内源性蛋白质与发光肽的标记ACS Chem。BIOL。13.,467-74。
  7. ,抗议;(2020)一种简单且可扩展的内源性蛋白质动态的策略。SCI。代表。10.8953。
  8. Daniels,D.L.,Riching,K.M.和Urh,M。(2019)细胞内监测和解密蛋白质降解途径药物讨论。今天技术。31.61 - 8。
  9. LIM,S.(2020)Bioprotacs建立RAS作为可降解的目标并提供新的RAS生物学见解。bioRxiv于2020年6月27日发布。
  10. 富人,小时(2018)PROTAC作用模式的定量活细胞动力学降解和机制分析ACS Chem。BIOL。13.,2758-70。
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前技术服务科学家凯尔还与产品开发的研发合作,现在专注于支持北美的Promega蜂窝分析产品。

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