用无细胞蛋白表达鉴定DNA修复蛋白

无细胞蛋白表达有助于研究人员仔细看看DNA双链休息。

一篇新文章自然科学报告解答关于TOPBP1的开放性问题,TOPBP1是一种参与修复DNA双链断裂(DSB)的蛋白质。使用的研究无细胞蛋白表达以及一个独特的DSB系统,以识别对蛋白激酶激活重要的域。

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HIF-1a-pVHL-ElonginB-ElonginC复合物的结构
HIF-1a-pVHL-ElonginB-ElonginC复合物的结构

威廉G。小凯琳,彼得爵士。拉特克利夫和格雷格L。塞门扎被授予2019年诺贝尔生理学或医学奖因为他们发现了细胞如何感知和适应氧气供应。

Kaelin和Ratcliffe的实验室将其努力集中在转录因子HIF(缺氧诱导因素)上。该转录因子对于核心可用性变化的细胞适应性至关重要。

当氧气水平升高时,细胞中含有很少的HIF。泛素通过VHL复合物添加到HIF蛋白中,并在蛋白酶体中降解。当氧气水平低(缺氧)时,HIF的数量增加。

2001年,这两个小组发表了描述VHL和HIF之间相互作用的文章,这些文章被诺贝尔奖组织引用新闻稿关于今年的奖项。(1、2)。这两项研究都表明,在正常的氧条件下,脯氨酸残基P564的羟基化使VHL能够识别并与HIF结合。

使用无细胞表达(即。,TNT偶联转录/翻译系统)是表征VHL的关键:HIF相互作用实验室利用HIF和VHL35-S标记蛋白在正常或低氧工作站下通过TNT系统生成:

  • 确定氯化亚铁和氯化钴对相互作用的影响
  • 绘制发生相互作用所需的HIF的特定区域(556-574)
  • 确定HIF点突变对相互作用的影响
  • 用合成的多肽来阻断相互作用
  • 得出结论,哺乳动物细胞中的一个因子是发生相互作用所必需的。

引用文献

  1. 伊万,M..(2001)低氧诱导因子脯氨酸羟基化对vhl介导的破坏:对O的影响2传感科学292: 464 - 67。
  2. Jaakkola, P。等等。(2001)O。HIF-α靶向von hipel - lindau泛素化复合物2- 调节脯氨酰化科学202,468-72。

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在最近的出版物(2)中,该测定用于评估针对ATP4A和ATP4B亚次的自身细胞H的ACATIBodies的存在+K+-萎缩性胃炎患者和对照组的ATP酶。继续阅读“Luciferase免疫沉淀系统测定(嘴唇):使用TNT转录/翻译套件表达荧光素酶抗原”

兔网织红细胞裂解液翻译系统:翻译调控分析的工具

诺如病毒颗粒透射电镜观察。图片来源:查尔斯·d·汉弗莱,疾病控制和预防中心
诺如病毒颗粒透射电镜观察。图片来源:查尔斯·d·汉弗莱,疾病控制和预防中心
兔网织红细胞裂解液翻译系统用于mRNA种类的鉴定,其蛋白产物的特性和转录和翻译控制的研究。兔网织红细胞裂解液取自新西兰大白兔。网织红细胞被裂解后,用微球菌核酸酶处理提取液以破坏内源性mRNA,从而将背景翻译降低到最低限度。

未经处理的裂解液从新西兰大白兔中制备,与处理过的裂解液相同,但不使用微球菌核酸酶处理。与从DNA开始转录/翻译的耦合系统不同,基于rna的兔子网织红细胞可以用于转录/翻译控制和rna病毒复制的直接研究。


参考文献

翻译调控的表征(即uts, Capping, IRES)

  1. Nguyen h l. (2013)人微粒体环氧化物水解酶新mRNA转录本的表达受其5’-非翻译区内的短阅读框调控。核糖核酸19, 752 - 66。
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  3. 白基义。.(2012)不经碱基逐碱基扫描的信使核糖核酸帽依赖翻译。Nucl。酸的物件。40, 7541–51.
  4. Se和北半球。Su.W。.(2011)含帽蛋白的mRNA的翻译、稳定性和抗脱扣性。核糖核酸17, 978 - 88。
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RNA病毒表征

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无细胞应用:苏木酰化特性

小泛素类修饰蛋白(SUMO)是一类与细胞内其他蛋白质共价结合或分离,以修饰其功能的小蛋白家族。SUMOylation是一种翻译后修饰,涉及各种细胞过程,如核胞质运输,
转录调控、细胞凋亡、蛋白质稳定性和应激反应。

与泛素相比,SUMO不用于标记蛋白质进行降解。当C-末端的最后四个氨基酸被切除以允许在目标蛋白质上形成SUMO和受体赖氨酸之间的C-末端甘氨酸残基之间的异肽键时产生成熟的SUMO。

细胞自由表达可用来表征蛋白质的sumoylation。靶蛋白在兔网织红细胞游离系统中表达(补充必要的添加成分)。经过修饰的蛋白质可以通过在聚丙烯酰胺凝胶上的迁移转移来分析,与对照反应相比。

下面的引用说明了在这个应用程序中单元格自由表达式的使用。

Brandl,。等等。(2012)动态调节的HDAC2磺酰化控制p53脱乙酰化,并限制基因毒性应激后的细胞凋亡。J.Mol。细胞。BIOL。(仅限在线)

简,一个。等等。(2010)。SUMOylation减弱聚集倾向和细胞毒性的多谷氨酰胺扩大共济失调-7。人类。摩尔。gen19,181-95。

雷廷基,M。等等。(2009)sumo化减弱pgc -1 α的功能。J. Biol。化学。284, 26184 - 93。

克莱恩,U。.(2009)在Borealin有丝分裂SUMO2/3结合-去结合周期中RanBP2和SENP3的功能摩尔。细胞。BIOL。20, 410 - 18所示。

SEO,W.和Ziltener,H.(2009)CD43加工和CD43细胞质尾核转位对细胞稳态是必需的。1143567-77。