为疫苗研究人员指明的道路:发光报告病毒检测中和抗体

研制一种安全、有效、易于生产和分发的疫苗是一项艰巨的任务。然而,这正是应对COVID-19大流行所需要的。

疫苗的开发、安全性和有效性测试需要时间。流行性腮腺炎疫苗被认为是迄今为止生产的最快的传染病疫苗,从样本收集到获得许可需要4年时间(2)。然而,有许多理由可以预测COVID-19疫苗的更快开发:研究人员正在以前所未有的方式开展合作,大多数COVID-19科学出版物向所有人免费提供,而且往往以预印本的形式提供。截至2020年8月11日,世界各地的研究人员165多名候选疫苗的发展,其中30在某些阶段的人体临床试验(1)。科学家可用疫苗配方的范围已经扩大到包括RNA和DNA疫苗,replication-defective腺病毒疫苗,灭活疫苗或灭活疫苗及亚单位蛋白疫苗。同样重要的是,疫苗开发人员和研究人员有更多的机会使用强大的分子生物学工具,如生物荧光报告器,使更快的测试和开发。

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活细胞中CDK抑制剂选择性的惊人景观

周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是癌症治疗中有希望的靶点,目前是药物发现中研究最深入的酶之一。FDA最近批准了三种针对该激酶亚家族成员的乳腺癌药物,引发了对整个家族的兴趣。尽管广泛的药物发现已经产生了许多CDK抑制剂(CDKIs),但很少在活细胞中被发现。那么这些化合物在细胞环境中到底有多强呢?这些化合物是选择性的CDK目标,还是它们在细胞中结合许多相似的激酶?为了解决这些问题,结构基因组学联盟和Promega的团队使用NanoBRET™目标参与技术发现了对CDKIs和被抛弃的临床先导物的选择性令人惊讶的模式(1)。该结果为重新利用一些抑制剂作为较少研究的CDK家族成员的选择性化学探针提供了令人兴奋的机会。

CDKs和CDKIs

用于激酶靶标接合的纳米obret技术

细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)调控一系列关键的整体细胞过程,包括细胞周期进程和基因转录。顾名思义,CDK的活性受到细胞周期蛋白相互作用的严格调控。在人类中,CDK亚家族由21个成员组成,其中几个被证实是肿瘤发生的驱动因素。例如,CDKs 1、2、4和6在细胞周期进程中发挥作用,并在肿瘤学中被验证为治疗靶点。然而,大多数剩余的CDK家族的研究较少。例如,CDK亚家族的一些成员,如CDKs 14-18,缺乏功能注释,在细胞生理中作用不明确。其他的,如密切相关的CDK8/19,是广泛参与基因转录的多蛋白复合物成员。这些激酶是如何在细胞环境中作为这些大型复合物的成员发挥作用的还不清楚,但它们的活性已经与一些病理相关,包括结肠直肠癌。尽管它们具有巨大的治疗潜力,我们对CDK家族成员的了解仍然不完全。

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用选择性化学探针照射暗激酶(DCLK1)的功能

被人清楚的Kinome代表了一个主要的挑战以及令人兴奋的药物发现机会。Dana Farber癌症研究所Nathanael Gray领导的研究小组能够部分阐明胰管腺癌细胞(PDAC)中未被充分研究的激酶,双皮质激素样激酶1 (DCLK1)的功能。PDAC中DCLK1的表征是通过开发一种高度特异性的化学探针来实现的(1)。Promega NanoBRET™目标接触(TE)技术使这种化学探针能够在细胞内表征。

黑暗的激酶组

NanoBRET目标订婚

由500多种蛋白质组成,人类Kinome是人类最广泛的酶之一,并且具有靶向小分子治疗的靶标。实际上,迄今为止,超过50种小分子激酶抑制剂已经达到了用于治疗癌症和炎症性疾病的FDA批准,其中临床评价的各个阶段具有近200激酶抑制剂(2)。此外,宽的基因组筛查努力涉及大部分激酶在人体病理(3)中的参与。尽管如此,但我们对Kinome的了解仅限于其家庭成员的一小部分(3,4)。例如,目前少于20%的人类激酶是针对临床试验中的药物。此外,只有一个历史上的冲击酶的子集在学术研究期刊(4)中已经获得了大量的引用。结果,大部分人类Kinome缺乏功能诠释;因此,这些被描述的或“黑暗”激酶仍然难以治疗干预(4)。

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NanoLuc®荧光素酶比报告试剂更强大

明亮NanoLuc®荧光素酶

NanoLuc®荧光素酶已经在这个博客上讨论了很多次我们的网站因为酶是研究遗传反应和蛋白质动态的一体化。虽然首先将Nanoluc®Luciferase作为报告酶来评估启动子活性,但其能力远远超过遗传报告者,而是创造用于研究内生蛋白质相互作用,靶接合,蛋白质降解等的工具。那么Nanoluc®Luciferase来自哪里,一种酶动力如何若干技术?

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调查雷德斯韦尔作为SARS-2-COV的可能治疗(2019年 - NCOV)

Remdesivir(RDV或GS-5734)用于治疗美国SARS-COV-2的第一种情况(1)(1)。RDV不是任何国家的批准药物,但已通过全球许多机构要求帮助打击SARS-COV-2病毒(2)。RDV是一种腺嘌呤核苷酸单磷酸酯类似物,用于抑制埃博拉病毒复制(3)。RDV在细胞内生物活化,并用作复制必要的RNA依赖性RNA聚合酶(RDRP)的替代底物。掺入底漆延伸产物的早期终止导致抑制作用。

注意病毒外表面的刺状突起,在电子显微镜下观察时,使病毒粒子周围呈现出冠状。在这个观点中,同样位于粒子外表面的蛋白质粒子E、S、M和HE也都被标记了。一种新型冠状病毒被确定为导致2019年中国武汉首次发现的呼吸道疾病暴发的原因。
这张由美国疾病控制和预防中心(CDC)制作的插图揭示了冠状病毒的超微结构形态。图片来源:Alissa Eckert, MS;丹·希金斯,疾病控制中心主任

为什么人们对RDV作为SARS-CoV-2治疗方法如此感兴趣?人们对RDV的兴趣主要来自于北卡罗来纳大学教堂山分校(Ralph S. Baric实验室)和范德比尔特大学医学中心(Mark R. Denison实验室)的合作小组与吉利德科学(Gilead Sciences)进行的一系列研究。

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靶向蛋白降解:药物发现的光明前景

靶向蛋白质降解和protacs

我们的细胞已经进化出多种“清除垃圾”的机制——分解和处理有缺陷、损坏或不再需要的细胞组件。在细胞内,这些过程通过新成分的合成来平衡,因此DNA、RNA和蛋白质不断发生变化。

蛋白质被细胞机械的两个主要组成部分降解。发现溶酶体在20世纪50年代中期,人们对这些细胞外和胞质蛋白质的降解机制有了相当深入的了解。在接下来的几十年里,第二种蛋白质降解机制的细节出现了ubiquitin-proteasome系统(UPS)。泛素是一种小的、高度保守的多肽,用于有选择性地标记细胞内降解的蛋白质。多泛素标签通常附着在单一目标蛋白上。这个倒霉的,泛素化的蛋白质然后被蛋白酶体识别,蛋白酶体是一个具有蛋白水解活性的大型蛋白质复合体。泛素化是一个多步骤的过程,涉及到几种特殊的酶。这个过程的最后一步是由泛素连接酶家族E3介导的。

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Promega Authors的流行论文

Promega是一家化学和仪器供应商,为全球不同行业和研究实验室的科学家提供服务。真实的。但我们不仅仅是一家供应公司;我们是致力于支持其他科学家工作的科学家。我们希望我们开发的技术背后的科学得到科学界的广泛审查和重视,这是我们的科学家花时间准备和提交手稿给同行评审的期刊的原因之一。在这里,我们列出了一些在2019年被广泛阅读的已发表研究论文。在《ACS化学生物学仅promega发表的五篇论文就在2019年阅读量最高的10篇论文中。下面是对这些ACS论文的简要回顾。

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设计报告构建体分析基因调控

生物荧光报告法是一种很好的选择为了分析基因调节,因为与比色或荧光测定相比,它们提供更高的灵敏度,更宽的动态范围和更好的信号到背景比率。在典型的遗传报告器测定中,用含有报告基因上游克隆的感兴趣序列的载体转染细胞,并且报告活性用于确定靶序列如何影响实验条件下的基因表达。编码在相同或不同质粒上的第二个控制记者是必不可少的内部控制。次要记者用于标准化数据并补偿由细胞数量、裂解效率、细胞活力、转染效率、温度和测量时间的差异引起的变异。

报告基因检测策略的基本介绍

对于基因报告子检测,使用具有弱启动子如PGK或TK的二次控制载体,以确保控制不干扰主要报告子载体的激活。转染大量对照质粒或将对照报告基因置于强启动子(如CMV或SV40)的控制下,通常会导致实验启动子的转录抑制或其他干扰(即反式效应)。报告基因分析还可以通过在下游或报告基因的3´处插入miRNA靶位点来定量评估microRNA的活性。例如,Pmirglo双荧光素酶miRNA靶表达载体是基于双荧光素酶技术,以萤火虫荧光素酶为主要报告因子监测mRNA调控和Renilla荧光素酶作为对照报告的正常化。

在这里的技术服务,我们经常与研究人员交谈,他们刚刚开始他们的项目,并寻求关于设计他们的基因报告载体的建议。他们有这样的问题:

  • 向量中包含多少上游推动者区域?
  • 需要多少个响应元素的副本才能提供一个好的响应?
  • 元素或周围序列的位置是否改变了基因调控?
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NanoLuc:小标签有大影响

合成生物学——通过基因工程使生物体做一些有用的事情——是每年iGEM竞赛的中心目标。在团队克服了克隆他们的基因的挑战后,下一个障碍是证明工程基因正在表达所需的蛋白质(并可能定量表达水平),他们可以使用报告基因来做到这一点。

报告基因也可以在iGEM项目中发挥更重要的作用,当团队用报告基因来设计他们的生物体,以检测特定分子的存在并发出信号,如环境毒素或生物标记物。的三个igem团队promega赞助今年选择合并一些版本NanoLuc®荧光素酶到他们的项目。

Nanoluc®Luciferase是一种基于来自深海虾的荧光素酶的小单体酶(19.1kda,171个氨基酸)Oplophorus gracilirostris.。这种工程酶使用一种新的底物,福莱玛嗪,产生高强度,发光型发光的atp不依赖反应。与其他标记和检测蛋白质的分子不同,NanoLuc®荧光素酶由于体积小,不太可能干扰酶活性和影响蛋白质生产。

NanoLuc®Luciferase也被设计成一个结构互补报告系统,NanoBiT®Luciferase,包含一个大亚基(LgBiT)和两个小亚基选项:低亲和SmBiT和高亲和HiBiT。这些NanoLuc®技术共同为iGEM团队提供了一个生物发光工具箱,用于解决一系列不同的生物挑战。

下面概述了每个团队的项目,以及他们如何将NanoLuc®技术整合到一起。

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为你的蛋白质选择标签

纯化卤素融合蛋白的流程图
HaloTag®哺乳动物蛋白纯化系统概述。

你已经确定并克隆了你感兴趣的蛋白质,但你想探索它的功能。蛋白质融合标记可能对你的调查有帮助。然而,为你的蛋白质选择一个标签取决于你计划做什么实验。你想要纯化蛋白质吗?你想通过下拉分析来识别相互作用的蛋白质吗?你对检查这种蛋白质的内源性生物学感兴趣吗?在这里,我们将介绍一些蛋白质标签的优点和缺点,以帮助您选择最适合您的需求。

亲和标签

最常用的蛋白质标签属于亲和标签的范畴。这意味着标签与另一个分子或金属离子结合,使其易于纯化或拉下你感兴趣的蛋白质。在所有情况下,通过克隆到表达载体,标签将在氨基(N)或羧基(C)末端融合到你感兴趣的蛋白质上。这种蛋白质融合可以在细胞或无细胞系统中表达,这取决于载体包含的启动子。继续阅读“为你的蛋白质选择标签”