多路细胞分析成功秘诀

分析单个样品中的多个生物标记物的细胞的能力是许多的原因是有利的。复用使研究人员能够节省时间和金钱,同时保护珍贵样品。此外,了解细胞的生物标志物之间的关系可以提供细胞健康的更完整的画面,可导致改善的预测模型用于药物发现。如果治疗效果是真实的还是系统的神器了解生物标志物的关系也可以最小化数据集和验证歧义。为了避免重复试验和提取多重实验生物学上最相关的数据,进行多重基于细胞的分析时需要考虑这些提示。

试验选择:选择与你正在研究的治疗结果相关的细胞分析,如细胞活力、凋亡和细胞毒性。多重测定应满足下列标准:
1.测定体积必须适合在测定的体积井或可以容易地物理分离。
2.每个分析的信号读数必须在光谱上是不同的。
3.测定化学试剂必须兼容(例如,避免沉淀或干扰自身荧光组分)
•在引入细胞裂解试剂进行分析之前,应先进行非溶解试剂的分析。这似乎是显而易见的,但是回顾分析化学反应背后的原理将有助于规划出你的多重程序。
•您可能需要在第一次检测中使用更浓缩的检测工作试剂,以便在井中留下足够的空间来添加适当体积的第二种检测试剂。关于浓缩检测试剂的任何说明,请咨询检测厂家的技术信息。
•当结合信号读出时,在荧光或发光分析的同时进行比色分析是不实际的,因为显色原有能力熄灭这些信号。如果样品可以被物理地分割或分离(培养基和细胞)到不同的孔中,那么测定化学反应将不会相互干扰。
•组合多种荧光分析应该是可能的,只要1)读数光谱清晰,2)没有共振转移,3)没有影响伴生荧光的猝灭剂(如洗涤剂、氧化还原),4)有最小的自发荧光。
•Promega已经成功地将基于细胞的检测与荧光和发光读出相结合。多路分析格式通常从荧光分析(非溶出)开始,然后是荧光分析(溶出)。这种格式的一个例子是ApoTox-Glo™三层分析多重生物标记物的检测是按顺序进行的。
•结合两种或两种以上基于发光的检测方法是困难的。目前,双Luciferase®报告检测系统提供了一种使用两种独特的生物荧光素酶的多重格式,萤火虫(Photinus pyralis)和海百合(海百合或三色堇)荧光素酶。在熄灭最初的萤火虫荧光素酶反应后,依次读取信号。因此,寻找包含不同luminogenic酶和包括猝灭剂的发光测定化学反应,以防止信号重叠时,多路复用。

细胞类型:细胞类型对实验设计、结果和解释有很大影响。确定细胞系是否适合多重分析格式,并考虑以下因素:
•当使用已建立的细胞系如Hep-G2和PC-3癌细胞时,存活率(活细胞)通常比原代培养细胞(如HUVEC、肝细胞)更高。
•相反,原代培养的细胞毒性标记(死亡细胞)水平较高,因为与稳定细胞系相比,原代培养的细胞自发死亡率更高。
•原代细胞可以提供一种用于测试化合物更生物学相关的模式,但它们可能需要的时间,以给定的这些细胞的寿命优化分析条件上的显著量。

细胞培养:培养细胞和保持细胞健康的复杂性会影响在多重测定中产生的数据的重现性和可靠性。细胞测定法比生物化学测定法具有更大的变异性,这已经不是秘密了,因为生物化学测定法的成分较少(例如,检测化合物、酶和活化剂)。最小化引入到细胞培养基中的变量以及如何处理细胞将有助于提高多路数据的质量。
•在可变结果的罪魁祸首是补充血清,通常牛,加入到培养基。总是限定一个新批次来自相同供应商的血清(例如,评估新的血清大量细胞生长行为)。如果可能的话进行大量的或长时间的研究时,使用单份血清不少。另一种选择是切换到无血清培养基中以避免影响血清对细胞的健康,并随后,测定结果。
•使用低通道数。细胞冻存物应生长到最佳的低传代次数(例如,分裂细胞20-22倍),在它们的峰值的代谢条件理想地提供细胞。较高传代数的细胞可改变特性,例如一个给定的表型的表达或抑制或显示活力下降。产生足够量的细胞在低传代数,然后冷冻等分试样用于每个试验,使得通路数目是一致的。
•在发表之前验证细胞系的身份已成为必需的实践。如果细胞生长或细胞对治疗的反应随时间不同,这可能表明需要验证细胞系的身份。
•应该优化贴壁细胞的胰蛋白酶化,因为过量的胰蛋白酶会杀死细胞,太少的胰蛋白酶会导致细胞聚集。分离不一致会导致不正确的细胞数计算,从而影响测定结果。
•使用台盼蓝排除确保活细胞被镀入实验孔。
•转染效率应该被测定,以确保细胞培养物之间的报道分子或生物标志物的表达相一致。
•避免移液不准确。当细胞在移液管中没有保持均匀的悬浮状态时,可以看到高度可变的结果。轻轻将细胞培养液从一孔到另一孔上下移动相同次数,然后移入。粗糙的移液管处理细胞可以杀死它们,造成低存活率和假细胞毒性。
•任何生物污染(如支原体、霉菌、细菌、其他细胞系)都可能改变实验反应。结果的再现性差可能是污染的信号。如果有任何疑问,就抛弃被污染的文化,以消除结果的模糊性。
•细胞密度的需求进行优化和一致的。分配到孔中稀疏细胞培养物相比,以高密度铺板的细胞显示出更高的检测灵敏度。较高细胞密度或培养物长满可以显示更高的背景信号,并且也可能需要更长的曝光时间,以测试化合物为任何可测量的效果。为了优化细胞密度,镀生成细胞数量的标准曲线(系列稀释)和测定存活力和细胞毒性。这将帮助你确定何时电池应及时治疗和多重测定进行。这将有助于确定的灵敏度和作为引入试验化合物以及之前的范围内测定系统的。

治疗参数:所有的测定参数都可能对多重测定的结果产生影响,但是对于一个给定细胞系,试验化合物的剂量和多重测定的时间对多重测定的成功有巨大的影响。
•时机就是一切。密切注意什么时候需要对给定的细胞系进行多重测定。生物标记物的半衰期会影响测定结果的准确性(例如,你是否能够在给定的时间点检测到生物标记物)。例如,在人K562细胞中,增加浓度的抑制组蛋白去乙酰化酶的Vorinostat™暴露于24小时后,caspase-3呈剂量依赖性增长。如果细胞暴露在抑制剂下48小时,caspase-3的反应就会消失,因此无法测量。相反,暴露1小时表明需要更大剂量的抑制剂来诱导细胞凋亡。因此,在生成剂量响应曲线(时间过程研究)时测试多个时间点可能很麻烦,但对于给药和治疗计划的信息质量很有价值。
•了解两个或更多生物标记物之间的关系以及它们何时出现(在治疗之前)有助于使多重检测更加可靠。例如,如果一个减少可行性标记不显示相应增加细胞毒性标记,然后我们可以推测,1。)一个化验测试化合物的影响,2)白细胞郁滞发生(活细胞不分裂)或3。)检测细胞毒性生物标志物的时间点已经过去了,试验应重复使用较短的曝光时间点。数据的解释可以通过多路复用来加强。

检测参数:多路分析可能受到所使用的检测仪器(荧光计、发光计和多模式平板阅读器)和分析消耗品的影响。当你希望提高你的多重分析的灵敏度或动态范围时,这里有一些需要考虑的变量。
•过滤器设置:未观察荧光信号的变化,你增加处理和未经处理的重复的细胞数可指示过滤器设置不正确。比较峰值激发和发射光谱对仪器滤波器集合范围内的每个荧光团。确保有至少在波长范围内与氟激发和发射格言过滤器的50%的重叠。
•仪器增益:如果你看到处理过的重复和未处理的重复之间有很大的误差条,你可能增益设置过低。
•微孔板:白色,不透明板提供荧光或发光读数更高信号,并且可以降低多重测定表现出饱和度的上限。然而,灵敏度可能不增加,因为会有更高的背景为好。黑色,不透明板具有较低的信号和背景的响应,但很少的串扰或光散射相比白色的,不透明的板材。如果发光信号重复之间变化超过2个日志,然后使用黑色不透明的,板,以限制串扰。透明底板允许你视图细胞形态前的测定,但可以有更多的串扰。

测定对照:重要的是要有控制,让你知道多元分析是否正常运作,并对所有样本中的变量进行数据正常化。
•非细胞控制定义了实验的背景(例如培养基、平板、试剂、检测器),并在数据处理中减去背景。
•未处理细胞对照显示任何载体效应,也用于分析确定相对响应率的fold response(例如,100%存活率,0%细胞毒性)。
•阳性对照使用已知的应答诱导剂(如细胞毒性、细胞凋亡),以了解通路效应。它也用于确定相对响应比的折叠响应(如100%存活率,0%细胞毒性)。
•多板试验对照是未处理细胞对照和阳性对照的复制。它说明了实验处理、温度、时间等的影响。

复用基于细胞的分析为您提供您所通过把它们放在一个更生物学相关的上下文测量生物标志物的信心。养成良好的细胞培养技术和优化的多重检测参数将提高你的研究活动数据的质量和可靠性。

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玛丽亚穗青葱

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